【摘 要】
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我国盐湖资源丰富,蕴藏着大量的嗜盐古菌。内蒙古高原得益于独特的气候,盐湖数目居全国首位,其中包含众多的盐碱湖。本文主要研究内蒙古查干诺尔盐碱湖可培养嗜盐古菌多样性,
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我国盐湖资源丰富,蕴藏着大量的嗜盐古菌。内蒙古高原得益于独特的气候,盐湖数目居全国首位,其中包含众多的盐碱湖。本文主要研究内蒙古查干诺尔盐碱湖可培养嗜盐古菌多样性,发掘新的嗜盐古菌资源,采用多相分类学方法确定分类学地位;从嗜盐古菌基因组中筛选出氨肽酶基因,进一步开展嗜盐古菌氨肽酶的异源表达和酶学性质研究,希望为食品加工用酶制剂的开发和利用提供科学依据。从内蒙古查干诺尔盐碱湖土壤中分离到89株嗜盐古菌。基于16S rRNA基因的系统发育分析表明,这些菌株分属于Natronococcus、Natronorubrum、Halovivax、Halovarius、Halalkalicoccus、CGA53、CGA73和CG73等8个属的15个分类单元,其中包含3个潜在的新的属级分类单元和8个潜在的新的种级分类单元,优势类群为Halalkalicoccus tibetensis。基于16S rRNA基因、rpoB′基因以及直系同源基因的系统发育、表型特征、细胞化学组分、基因组分析结果表明,菌株CGA30代表Halovivax属的一个新种(Halovivax salinus sp.nov.),菌株CGA73代表一个新属(Natronorubellus halophilus gen.nov.sp.nov.),两者均属于嗜碱嗜盐古菌。获得的新类群中,菌株CGA30和菌株CGA73均能产生较高活性的氨肽酶。菌株CGA30含有一条M42家族氨肽酶基因(CGA302942),菌株CGA73则含有3条M42家族氨肽酶基因(CGA731020、CGA732402和CGA732818)。预测结果显示,这四个氨肽酶均为正四面体、十二聚体、金属氨肽酶,其活性位点和金属离子结合位点与M42家族氨肽酶高度保守。将上述氨肽酶通过异源表达以及进一步亲和层析纯化,获得纯化的嗜盐古菌氨肽酶。氨肽酶CGA302942的表观分子量为65 kDa,氨肽酶CGA731020、CGA732402和CGA732818的表观分子量分别为58、52和60 kDa。将对赖氨酸底物活性最高的氨肽酶CGA732402命名为NhTET,并对其进行酶学性质表征。该酶底物特异性广,尤其对赖氨酸底物水解能力最强,最适反应温度为65℃,反应最佳NaCl浓度为4.9 M,最佳KCl浓度为2.5 M,最适反应pH为8,属于极端嗜盐酶。NhTET能耐受部分有机溶剂,其活性能被EDTA、PMSF、DTT和β-巯基乙醇抑制,且金属离子Cu2+、Mn2+等均能使酶活增强。这四种新型酶的发现扩充了嗜盐古菌氨肽酶资源,可以用于高盐腌制食品(如虾酱、鱼酱)的发酵,为进一步食品加工用酶制剂的开发与应用研究奠定基础。
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