GLP-1/GIP双受体激动剂通过调节星形胶质细胞FEZ1表达对PD模型的神经保护作用研究

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帕金森氏病(Parkinson’s disease,PD)所面临的临床难题包括无法在疾病早期阶段做出明确诊断,以及在后期阶段难以控制病情。此外,没有任何疗法可以减缓帕金森氏病神经变性进程。探究具有神经保护或疾病修饰性的药物已成为PD临床治疗的关键之一。大量文献报道,胰高血糖素样肽1(Glucagon-like peptide 1,GLP-1)GLP-1受体激动剂能够在神经退行性疾病中显示出良好的神经保护作用,改善中枢神经系统内细胞生物学功能。然而,其具体机制尚不清楚。成束和延伸蛋白ζ-1(Fasciculation and elongation protein zeta-1,FEZ1)特异性表达于神经系统,参与轴突生长、微管运输和神经发育。我实验室的前期研究表明,FEZ1在PD模型中星形胶质细胞的表达明显高于神经元,且能够参与多巴胺神经元发生分化和多巴胺释放调节。因此,本实验研究GLP-1受体激动剂DA-JC1处理PD模型,是否通过调控星形胶质细胞FEZ1表达而达到有效保护作用。同时,也为帕金森疾病的治疗和预防提供一个新的参考。目的:通过建立PD模型,研究GLP-1/GIP双受体激动剂DA-JC1对PD模型的作用,以及FEZ1在处理前后的表达变化,探讨FEZ1表达变化在其中的意义及其可能机制。方法:(1)通过CCK-8检测确定GLP-1/GIP双受体激动剂DA-JC1和6-OHDA最佳使用浓度,采用6-OHDA体外诱导SH-SY5Y细胞建立PD细胞模型,设预防组(DA-JC1+6-OHDA)、模型组(6-OHDA)、治疗组(6-OHDA+DA-JC1)和正常组(Control)。预防组提前24 h给药后6-OHDA处理,治疗组6-OHDA处理24 h后给药。DA-JC1分别处理后,通过镜下观察SH-SY5Y细胞形态变化,CCK-8检测细胞存活率,western blot检测各组细胞内FEZ1/BCL-2/BAX蛋白表达变化。(2)立体定位注射6-OHDA(2μg/μL)于前脑内侧束(MFB)建立PD大鼠模型,分别设预防、治疗、模型和sham组,sham组手术至硬脑膜下。DA-JC1(25 nmol/kg)腹腔连续给药6d,每天记录各组大鼠饮食和体重变化。(3)第1、3、7天通过旷场实验记录其行为学变化,通过阿扑吗啡(APO)诱导记录其处理前后的旋转数量变化。(4)应用western blot 检测 FEZ1/TH/GFAP/CREB(cAMP 反应元件结合蛋白,cAMP response element-bindingprotein)在黑质和纹状体中表达变化,采用免疫荧光组织化学观察TH/GFAP在黑质中表达变化,通过免疫共沉淀实验观察FEZ1/CREB的相互作用关系。结果:(1)通过CCK-8检测结果确定DA-JC1最佳使用浓度为1μmol/L时,细胞的增值率最大,6-OHDA最佳使用浓度为150μmol/L;镜下观察结果得知,预防组细胞形态完好,悬浮细胞较少;通过CCK-8检测预防组细胞凋亡率(13.32%)明显低于治疗组(31.50%)和模型组(32.48%),统计具有显著性差异(p<0.01);Western blot检测也发现FEZ1在预防组中表达最高,BCL-2表达增高。(2)6-OHDA损伤后2周大鼠出现明显的旋转行为,通过记录体重和饮食发现,在注射DA-JC1后的PD大鼠体重明显减少且增长慢,统计各组日饮食重量并无显著差异。(3)行为学实验结果表明,治疗组的水平运动能力得到明显改善(P<0.01),治疗组大鼠相比更表现出情绪缓解能力(P<0.05)。阿扑吗啡诱导30 min内数据表明治疗组(p<0.001)和预防组(p<0.05)大鼠旋转次数明显少于模型组,大鼠的旋转行为得到改善。(4)Western blot检测FEZ1结果与细胞模型一致,治疗组与预防组PD大鼠TH和GFAP蛋白表达变化与FEZ1表达也有相似的趋势;免疫荧光组织化学结果显示,DA-JC1处理后,对黑质TH神经元形态和数量都有明显的保护作用;免疫共沉淀实验发现CREB与FEZ1具有相互作用,提示FEZ1的表达是受cAMP-PKA通路调控的。结论:(1)DA-JC1对SH-SY5Y细胞具有增殖作用;(2)DA-JC1能够改善PD大鼠运动症状;(3)DA-JC1通过cAMP-PKA途径调控FEZ1的表达,进而对PD模型起神经保护作用;(4)FEZ1可作为治疗PD疾病的潜在靶点。
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