研究背景急性白血病是血液系统常见的恶性疾病,其发病率呈逐年上升趋势,尽管在过去的十年,对该疾病的诊断及治疗方面有长足的进步,研究其发病机制和相应的治疗策略仍然是血液学界重要的课题。以往的研究中,学者们大都关注白血病干细胞本身如细胞表面抗原变化、细胞遗传学改变、基因的重组、突变等。近些年的研究资料显示,骨髓造血微环境的改变也是参与其中的重要因素,白血病细胞在造血微环境中增殖,并不断促进其发生变化,造血微环境的改变也为白血病细胞提供了必要的生长条件,二者共同促进疾病的发生发展。骨髓血管新生是骨髓造因微环境改变的一项重要病理过程,其主要参与者包括血管内皮细胞、细胞因子、信号传导通路及白血病干细胞本身。在这个过程中,参与其中的诱导因子表达上调,而抑制因子相对减弱,刺激循环内皮细胞向肿瘤周围迁移、增殖,形成新生的血管。在众多因子中,目前认为起关键作用的是血管内皮生长因子(VEGF),它在血液系统肿瘤中的研究在不断进展中。上世纪90年代,骨髓血管新生现象在多发性骨髓瘤患者中被发现。随后的研究发现,这种现象也同样存在于急性白血病中。随着分子生物学的飞速进展,人们对肿瘤治疗的目标,已不再满足于细胞和蛋白水平。一般认为,下调特定基因的mRNA表达策略是研究基因功能及有希望治疗肿瘤的有效途径。在分子水平控制基因表达已经成为重要的课题,miRNA的发现,给这个课题带来了新的希望。MicroRNAs(miRNAs)在转录后的调控起着重要的作用,其本身并不改变基因序列,而是与靶基因互相作用,通过上调或抑制其表达而发挥调控作用。miRNAs参与了真核生物几乎所有的生物学过程,另外被发现的miRNAs多数位于脆性位点与癌症相关的基因组区域,也是肿瘤发生发展的重要机制。多个研究报告表明,miRNA参与了内环境稳态的维持,miRNA表达谱往往是观察各类疾病的生物学指标。许多miRNAs在血浆中能被检测出来,随着分子生物学技术的不断成熟,其不仅可能成为一些疾病的生物学标记,还可能对疾病分型、评估疗效及判断预后有重要参考意义。活跃的血管生成是导致肿瘤患者快速复发和低生存率的重要原因。众多miRNAs参与了这个过程。然而,确定miRNA与血管新生的关系是十分复杂过程,具有巨大的挑战性,因为一个miRNA可能对应数百或甚至数千个目的基因,一种基因可以受数目众多的miRNAs调控。根据数据库基础资料及前期我们对AML患者血浆中miRNAs表达谱的筛选研究,发现miR-638可能以"抑癌基因"角色参与肿瘤血管生成过程,然而其表达情况及具体机制尚未清楚。研究目的观察急性髓系白血病患者骨髓血管新生情况,并对骨髓单个核细胞VEGFA-mRNA及miR-638水平进行检测,根据临床资料及检测结果,分析二者在AMIL血管新生中可能的作用。进一步以白血病细胞系为研究对象,上调或下调miR-638表达水平,观察VEGFAmRNA及蛋白表达变化。通过临床观察及基础研究,探讨miR-638、VEGFA在骨髓血管生成中的作用,并为寻找新的生物学标志物及新的治疗方法奠定基础。研究方法临床研究:1.选取77例急性髓系白血病患者及21列正常人为观察对象,免疫组化法以Anti-vWF抗体标记微血管内皮细胞,检测骨髓微血管密度(MVD);收集并分离骨髓单个核细胞,qTR-PCR法检测miR-638、VEGFAmRNA表达情况。并分别分析MVD、VEGFAmRNA、miR-638与临床特征的关系及三者表达水平相关性。2.标准化疗1周期后,评估缓解状态,收集标本,再次检测骨髓MVD及单个核细胞VEGFAmRNA、miR-638表达水平,与治疗前进行配对比较并分析相应的变化。基础研究:1.以白血病细胞系K562、HL60和人脐静脉细胞系HUVECs为研究对象,常规方法进行细胞培养,检测miR-638、VEGFA表达情况。2.上调/抑制miRNA-638表达实验质脂体转染法转染miR-638mimics及其抑制物miR-638 inhibitor于K562和HL60细胞株中,用qRT-PCR法检测转染后细胞miR-638、VEGFAmRNA表达水平,应用Western blot法检测VEGFA蛋白水平变化。3.荧光素酶基因报告实验根据miR-638与VEGFA3’-UTR端结合位点设计引物。PCR扩增后双酶切,连接到pmirGLO质粒载体中,定点突变VEGFA3’-UTR相应的种子序列并连接于载体中,由此分别构建了 VEGFA野生型3’UTR和突变型3’UTR荧光素酶报告基因质粒,与miR-638共转染K562和HL60细胞,以Negative control作为阴性对照,培养48小时后加入底物发光,检测荧光水平。4.Transwell细胞共培养实验以内皮细胞HUVECs为观察对象,应用Transwell小室(聚酯膜的孔径为0.4μm)与转染miR-638及miR-638inhibitor的K562、HL60细胞共培养,模拟白血病细胞对内皮细胞增殖的影响,应用MTT法检测HUVECs的增殖情况。研究结果临床研究结果:1.应用免疫组化法检测正常人及AML患者微血管密度(MVD),高倍显微镜下(100×)观察骨髓切片,发现vWF标记的AML患者骨髓微血管的形态与正常人存在差异。77例初发AML患者MVD明显高于正常对照组,在伴有髓外浸润者尤为显著。经标准化疗1周期后,评估疗效,达CR者60人,NR者17人。化疗后患者骨髓MVD仍偏高。所有患者治疗前后进行配对t检验,治疗后MVD较治疗前下降;CR组与NR组无统计学差异。2.qRT-PCR法检测AML患者VEGFA mRNA相对表达含量,结果显示,初发AML患者与正常组比较明显增高,且在高原始细胞比例组(BM-blasts>50%)VEGFAmRNA表达水平明显高于<50%组。化疗1周期后,VEGFAmRNA表达水平仍偏高,与对照组比较有统计学意义;所有患者治疗前后进行配对t检验,治疗后VEGFAmRNA表达水平较治疗前明显下降。3.qRT-PCR法检测骨髓单核核细胞miR-638表达,结果显示,miR-638在初发AML表达下降,明显低于正常对照组;经1周期治疗后与初发时进行配对比较,其表达上调,有统计学差异;NR组miR-638表达水平仍偏低,与CR组比较有统计学差异。按临床特征分析AML患者骨髓单个核细胞miR-638表达情况,其表达骨髓增生程度,白血病类型、有无髓外浸润及细胞遗传学改变无相关性。按骨髓原始细胞比例分组,AML患者骨髓原始细胞>50%组表达水平明显低于<50%组,有统计学差异。4.将所有AML患者MVD与VEGFAmRNA及miR-638相对表达含量进行相关性分析,结果显示,MVD与VEGFAmRNA呈显著正相关(r=0.583,P<0.05);miR-638 与 VEGFAmRNA 呈显著负相关(r=-0.389,P<0.05)。5.生存分析骨髓MVD偏低组患者总生存期较偏高组明显延长,VEGFAmRNA及miR-638相对表达含量与生存期无明显相关性。基础研究结果:1.miR-638在白血病细胞株K562、HL60中的表达水平较正常单个核细胞明显减低。以 miR-638mimics 和 miR-638 inhibitor 转染 K562 和 HL60 细胞株,转染后应用qRT-PCR法进行检测miR-638表达情况。转染miR-638mimics的细胞株,其表达水平上调,明显高于Negative Control组;而转染miR-638inhibitor的细胞株,表达水平下调,与Negative Control比较,有统计学差异。2.转染miR-638mimics的细胞,VEGFAmRNA和蛋白表达水平下降,较Negative Control 组有明显差异,而转染 miR-638inhibitor 的细胞 VEGFAmRNA和蛋白表达水平与Negative Control组相比较,无明显差异。3.荧光素酶报告基因实验VEGFA-3’UTR野生型报告质粒与miR-638共转染,荧光素酶活性较对照组及突变组比较明显下降,而突变型VEGFA-3’UTR报告质粒与miR-638共转染,荧光素酶活性与对照组相比,无明显差异。此结果证实,VEGFAmRNA的3’UTR端是miR-638的直接作用靶点,miR-638通过靶向VEGFA-3’UTR调节其蛋白表达,进而以挥其对血管生成的调控作用。4.应用Transwell细胞共培养技术,观察miR-638转染后的白血病细胞系K562、HL60对静脉内皮细胞的影响,并用MTT法检测HUVECs的增殖能力。结果显示,K562细胞转染miR-638mimcs组紫外光吸光度值(OD)较miR-638 inhibitor组及对照组明显减低,miR-638 inhibitor组较对照组比较无明显差异;HL60细胞转染miR-638mimcs组OD值较miR-638 inhibitor组及对照组明显减低,miR-638 inhibitor组较对照组明显升高,有统计学差异。研究结论骨髓血管新生是急性髓系白血病重要的病理过程,骨髓微血管密度的检测对白血病判断预后有重要意义。miR-638在急性髓系白血病中表达减低,与血管内皮生长因子(VEGFA)呈负相关,VEGFAmRNA的3’UTR端是miR-638的直接作用靶点,VEGFAmRNA是miR-638的靶基因,可以通过对VEGFA的调控间接对内皮细胞的增殖产生抑制作用从而参与白血病骨髓血管新生。miR-638可能成为检测骨髓血管新生的生物学标记物及白血病抗血管新生治疗的作用靶点。