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由禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum,有性态为Gibberella zeae（Schwein.））引起的赤霉病是麦类作物的重要病害,造成大小麦的严重减产,产生的毒素影响粮食品质。瓜类炭疽菌（Colletotrichum lagenarium）引起的炭疽病是西瓜、黄瓜上主要的叶部和瓜果病害。但是,目前对这2种重要病原真菌致病性分子机理的认识还很有限。利用功能基因组学技术筛选分离致病性突变体,并克隆鉴定致病性相关的关键功能基因,可加速对禾谷镰刀菌和瓜类炭疽菌生物学及其致病机理的认识。本研究旨在构建一个适合真菌遗传转化、带有报道基因的双元载体,建立和优化农杆菌介导的禾谷镰刀菌和瓜类炭疽菌转化体系,创建禾谷镰刀菌和瓜类炭疽菌的T-DNA插入突变体,分析转化子的形态特征,筛选和初步分析致病性突变体。 为了构建一个带有报告基因、适用于农杆菌介导真菌转化的双元载体,我们构建了一个Aspergillus nidulans trpC基因启动子-GFP-GUS-trpC终止子构件,并将该构件克隆进pBIG2RHPH2的T-DNA区域,获得pBIG2RHPH2-GUS-GFP。用pBIG2RHPH2-GUS-GFP双元质粒转化后形成的转化子,能在含潮霉素培养基上生长,而且能表达GFP和GUS等报告基因活性。 经过对农杆菌与真菌孢子共培养时间、农杆菌和真菌孢子的浓度、抗生素种类及其使用浓度等因子的优化,我们建立了农杆菌介导的禾谷镰刀菌和瓜类炭疽菌的转化体系。用含25μmol/L乙酰丁香酮（AS）、OD600=0.12～0.15的农杆菌和等体积真菌孢子混合,25℃振荡培养24h,再涂布于含100μmol/LAS MM固体培养基上的尼龙膜,24℃黑暗培养24h,洗下尼龙膜上的农杆菌和孢子混合液,涂布到含有50μg/ml氨苄青霉素、200μg/ml头孢霉素和200μg/ml潮霉素PDA平板筛选转化子。运用优化的转化体系,我们可以从1×106孢子得到200-250个禾谷镰刀菌T-DNA插入转化子和150～200个瓜类炭疽菌T-DNA插入转化子。 对所获得的潮霉素抗性转化子进行了分子鉴定以及报告基因表达水平检测。PCR检测表明,所有潮霉素抗性转化子菌株都能从其基因组DNA中扩增到双元转化载体pBIG2RHPH2-GUS-GFP中的GUS基因片段,说明双元载体中的T-DNA已经整合进禾谷镰刀菌和瓜类炭疽菌的基因组中。显微镜观察显示,所有转化子