研究目的肝癌位列常见恶性肿瘤的第五位,已成为危害人类健康的重大疾病。WHO的《全球癌症报告》研究指出,全世界肝癌发病率及死亡率男性是女性的2-3倍。越来越多的研究证实肝脏是内分泌型器官,其生理学功能的发挥部分依赖于性激素的调节。然而,有关肝癌性别差异性的机制研究较少。目前,临床对肝癌患者主要采取化疗药物、手术切除、放疗等方法进行治疗,其中亦包括激素类药物的治疗,但是治愈效果均不是很理想。药物的副作用、手术后复发率较高、放化疗后病人机体免疫受损的问题仍很凸显,所以阐明肝癌发生的分子机制,揭示肝癌发生率性别差异的信号网络,寻找、明确新的诊疗方法仍然任重道远。目前的观点认为,雄性激素发挥促进肝癌的作用,而雌性激素发挥抑制作用,这可能是肝癌性别差异的主要原因。近年来,关于激素与肝脏中的模式识别受体的相互作用关系引起了学者的关注,早在2007年就有研究发现TLR4下游MyD88分子与肝癌的雌雄性差异密切相关,2015年最新研究发现在雌激素刺激ER引起MAPK信号通路激活影响肿瘤细胞生物学特征改变的过程中,NLRP3发挥重要的作用。模式识别受体包含TLR、NLR及RLR三大家族,本实验室关注了TLR家族的TLR4分子及NLR家族中最经典的两个分子NOD1和NOD2。其中,TLR4分子主要是被肠道中的有害成分脂多糖(LPS)活化,肠道菌群通过肝肠轴作用激活肝细胞上的TLR4分子,促进肝纤维化、肝硬化及肝癌的发生,但是TLR4与肝癌雄激素受体AR之间是否存在‘’cross-talk",进而共同促进肝癌,尚未见文献报道。围绕NLR家族中的NOD1/NOD2分子的研究主要集中在结肠癌和胃癌中,相关的研究结论主要认为NOD1/NOD2分子发挥促进癌症的作用。值的我们关注的是,NOD分子亦表达在肝实质细胞、Kupffer细胞及肝星状细胞中,但是NOD与肝癌、雌激素或雄激素之间的关系尚没有详尽论述,同样值得我们进一步探讨。基于上述现象,我们通过DEN/CCL4体内诱导的HCC小鼠模型并结合肝癌细胞系体外实验,展开了以下两方面的研究：一方面研究了研究了雄激素受体AR与TLR4分子之间的相互调控网络,发现了两者共同调控肝癌恶性增殖、迁移、侵袭等的现象,为临床肝癌激素类治疗及新型靶向治疗药物的研发提供了新的方向。另一方而,雄激素受体AR通过NOD1及其下游通路调控肝癌的现象,首次明确了NOD1和NOD2分子在肝脏中的作用,并阐明了NOD分子在肝癌性别差异产生的内在机制。研究方法第一部分AR促进TLR4诱导的肝癌1.采用Real-time PCR和FACs检测雌雄小鼠基础及HCC诱导后TLR4及AR的表达情况；利用免疫荧光检测人鼠肝癌细胞系中TLR4和AR的表达情况；2.采用western blot实验检测性激素刺激后检测TLR4分子的表达变化；3.采用MTT法、细胞平板克隆实验检测DHT和LPS对肝癌细胞增殖能力的影响；PI单染、Annexin V/PI双染法分别检测DHT和LPS对人和鼠肝癌细胞系周期、凋亡的影响；4.免疫组化检测WT型及TLR4-/-小鼠Ki67的表达情况；采用Real-time PCR检测小鼠肝实质的Ki67、PCNA、Acta2及AFP mRNA的表达水平；5.免疫组化检测HCC样本中TLR4和AR的表达。第二部分NOD1促进AR调控肝癌进程的作用1.采用DEN联合CCL4诱导C57BL/6肝癌小鼠,利用Real Time-PCR对诱导早期的小鼠肝实质细胞的恶性增殖指标Ki67、PCNA、Acta2及AFP mRNA的表达水平进行检测；通过HE染色检测肝组织中炎症浸染状况；利用IHC检测Ki67在雌雄小鼠中表达差异；2. Real Time-PCR检测诱导小鼠肝实质NLRs mRNA的表达水平；通过western-blot实验、IHC实验及荧光定量PCR法检测在诱导肝癌的进程中肝癌细胞中的NOD1/NOD2是否是功能性表达；3.采用Real Time-PCR法检测几种常见的人肝癌细胞系NLRs、AR及ERmRNA的表达水平；通过western-blot实验及Real Time-PCR法检测肝癌细胞中的NOD1/NOD2是否是功能性表达；4.采用划痕实验、Transwell方法检测激素与NOD激动剂对肝癌细胞的迁移和增殖是否产生影响；利用激素及NOD激动剂对DEN/CCL4诱导的HCC模型进行预先刺激,然后通过Real Time-PCR和IHC对诱导小鼠肝实质的Ki67.PCNA、 Acta2及AFP mRNA的表达水平进行检测,观察表达差异；5.通过PI单染、Annexin V/PI双染法分别检测激素和NOD激动剂对人肝癌细胞系HepG2. H7402细胞周期、凋亡的影响；6.免疫组化检测肝癌模型小鼠的癌组织部位及癌旁部位NOD1分子的表达,组织芯片中原发性肝癌进程早期患者NOD1、NOD2、RIP2在癌变部位及正常部位间的表达差异,同时统计其表达与男女性患者的相关性。研究结果第一部分AR协同TLR4调控肝癌进程的作用1. DEN/CCL4诱导雄性小鼠TLR4和AR mRNA及蛋白水平表达更高,在HCC细胞系中也观察到TLR4和AR的蛋白水平表达。2.DHT能显著上调TLR4分子的表达,E2则能抑制TLR4的表达。3.LPS显著增强肝癌细胞的AR的表达。4.LPS和DHT联合刺激下肝癌细胞增殖明显,并能显著促进肝癌细胞系细胞周期由G1期向S期过渡,但对凋亡无影响。5.LPS和DHT联合刺激下肝癌细胞迁移明显增加。6. DEN/CCL4诱导小鼠,TLR4-/-小鼠Ki67蛋白水平表达更低。7.HCC样本中肝癌组织中TLR4和AR的表达比癌旁组织表达高,两者正相关。第二部分AR与NOD1分子调控肝癌进程的作用1. 经DEN/CCL4诱导后,雄性小鼠肝实质的Ki67、PCNA、Acta2及AFP mRNA的表达明显高于雌性小鼠,且Ki67的蛋白水平在雄性小鼠肝脏表达更高,且雄性小鼠炎症状况亦比雌性小鼠严重,提示雄性小鼠比雌性小鼠更易发生肿瘤。2. DEN/CCL4诱导的小鼠,NLRP3和AIM2 mRNA水平无明显变化,但是发现雄性诱导小鼠NOD1分子表达上调,而雌性小鼠却未见变化,NOD2分子则变化相反。3. 雄性小鼠在诱导的中期、后期NOD1分子mRNA和蛋白水平随时间推进而上调,雌性小鼠则下调；而NOD2分子变化结果则相反。4.肝癌细胞系HepG2、H7402及HepG2.2.15表达NOD1、NOD2、AR及ER。5.性激素与NOD1呈依赖关系,且DHT刺激NOD1分子高表达,E2则刺激NOD1分子低表达,NOD2分子则相反变化,说明性激素参与调控NOD分子在肝癌进程中的作用。6.DAP联合DHT组迁移更明显,且小鼠模型试验中也发现预先联合进行DHT和DAP刺激组小鼠恶性增殖指标表达更高的现象。7.通过实验发现DHT和NOD激动剂对细胞的凋亡没有影响。8.肝癌进程患者的NOD1和AR分子在肿瘤部位较癌旁组织表达较高。结论及意义1本文首次发现TLR4分子与AR可协同调控肝癌,开拓了激素类调节肝癌患者治疗的新思路,激素类药物联合TLR4小分子拮抗剂或可增强肝癌的治疗效果；2首次对肝癌细胞NOD1/NOD2的功能进行研究,并阐明了其内在机制,发现NOD1与AR协同调控肝癌发生发展,介导了肝癌细胞的增殖。