论文部分内容阅读
蛋白质是生理功能的执行者,对蛋白质结构和功能的研究是生命科学研究中的热点。激酶催化下的磷酸化修饰涉及细胞信号传导、肌肉收缩、神经活动以及细胞的增值、发育和分化等生理病理过程。磷酸化的异常以及激酶的过度表达往往与许多重大疾病有关,如癌症、糖尿病和老年痴呆症。目前对蛋白激酶活性的传感研究不多,方法局限,因此开发检测蛋白激酶新方法和筛选抑制剂用于临床治疗亟不可待。另一方面,研究氧化还原蛋白质在电极界面的直接电子传递对理解他们在生物体内电子转移机制和生理作用具有重要意义。然而蛋白质的活性中心深埋在内部,很难实现蛋白质的直接电化学。为了实现蛋白质可逆的电化学行为,探索电子传递的促进剂是大家关注的焦点。基于以上考虑,综合文献报道,本论文利用不同纳米材料(纳米金、量子点、石墨烯等)的独特性质,开发出多种无标记快速蛋白激酶活性检测方法。另外,将玻碳、碳纳米管进行电化学阴极处理,实现了氧化还原酶的直接电化学。具体细节如下：(1)构建了一种基于未修饰CdTe量子点聚集行为的无标记荧光分析方法用来检测蛋白激酶活性及其抑制作用。带正电的底物多肽引起表面带负电荷的CdTe量子点有选择性的聚集。激酶催化底物多肽磷酸化,由于磷酸基团的引入,改变了多肽的电荷,阻碍了量子点的聚集,引起荧光信号加强、发射波长有45nm蓝移,且荧光发生由黄到绿的颜色变化。因此,荧光强度及其颜色的响应,使得这种基于量子点聚集的荧光分析法可以通过光谱仪甚至肉眼较容易地检测到蛋白激酶活性。对蛋白激酶PKA的检测有较低的检测限(0.47mU μL-1),其高灵敏检测证实了该方法在开发蛋白激酶活性分析方法上的可行性。基于量子点的荧光响应,估算得出的PKA的抑制剂H-89的IC5o值为138nM,与文献值相当。此外,该方法可以用来检测在Forskolin/IBMX激活的细胞裂解液中的PKA。本方法相对于以往的激酶活性检测方法相比,不需要多肽标记和量子点修饰,为实现高效低耗检测激酶活性和抑制剂的筛选提供可能。(2)设计了一种用于检测蛋白激酶活性及抑制剂的Label-free型电化学方法,即利用Zr4+与磷酸基的稳定交联,将DNA修饰的金纳米粒子(DNA-AuNPs)与磷酸化多肽交联。由于DNA-AuNPs带大量负电荷,电活性物质[Ru(NH3)6]3+分子便能定量地吸附在磷酸化位点上,因此可以通过[Ru(NH3)6]3+的信号采用电化学计时电量法检测蛋白激酶的活性。抑制剂H-89对于PKA的IC50值估算为33nM,与文献报道相近。(3)介绍了一种基于压电石英晶体微天平(QCM)实时监测适配体多肽与蛋白激酶相互作用的、新颖的、一步法快速检测蛋白激酶的方法。以PKA为例,将IP20作为适配体多肽通过组氨酸标签(His6-tag)与金属离子的螯合作用,相同取向地固定在压电石英晶体金电极表面,这一多肽组装方法避免了蛋白的非特异性吸附。QCM对蛋白激酶结合上IP20表面的灵敏频率响应,使得我们能实时监测蛋白激酶,并且能定量分析蛋白激酶PKA的浓度。与之前报道方法不一样的是,适配体多肽与蛋白激酶之间的识别不涉及激酶催化的磷酸化过程,因此监测快速无需标记,也不需要设计信号输出机制获得最终实验结果,可以实现蛋白激酶的一步法检测(时间不超过10min)。这一新方法同样可用于在细胞裂解液中分析PKA催化亚基的含量。(4)首次提出了一种基于石墨烯／多肽复合物和羧肽酶降解作用的激酶活性分析方法。FITC标记的CKII底物多肽FITC-peptide (FITC-RRRADDSDDDDD),能与GO发生有效的荧光淬灭。羧肽酶CPY能作用于任何一个C-末端残基,从肽链的C端开始逐个降解,释放出游离氨基酸。FITC-peptide在CPY的消化作用下释放出游离的FITC分子,在高离子强度环境下,游离FITC分子与GO之间的吸附较小而保持相当强的荧光。而当FITC-peptide在CKII/ATP催化发生磷酸化,有效地阻碍CPY在磷酸化丝氨酸位点的降解,使得FITC-多肽更容易与GO结合而导致荧光淬灭。因此根据荧光强度的变化可以检测蛋白激酶的活性。这种由蛋白激酶催化磷酸化诱导的多肽/GO复合物荧光强度的变化,有望为高通量检测蛋白激酶活性及其筛选抑制剂提供新的思路。(5)在含0.05M四丁基溴化铵(TBAB)的二甲亚砜(DMF)溶液中,用电化学循环伏安法可以得到表面纳米化玻碳(SNGC)电极,玻碳电极表面的含碳微粒的粒径分布在10-40nm之间。相对于普通的玻碳电极,表面纳米化玻碳电极对葡萄糖氧化酶GOD的直接电化学有更高的催化活性,原因在于SNGC电极表面呈现出高比例的边缘原子。在SNGC表面,GOD的循环伏安曲线呈现一对完好的、准可逆的氧化还原峰。(6)本文提出了一种改良碳纳米管(CNT)电催化性能的简单便利方法,并将其用于生化酶的直接电化学。在含0.05M TBAB的DMF中,将CNT修饰电极从0--2.8V电化学循环伏安扫描10个片段,得到阴极修饰碳纳米管(CM-CNTs)。透射电子显微镜(TEM)下观察到刻蚀后的CNT呈现较多的缺陷,因此裸露出更多的碳边缘原子,有效地改良了碳纳米管的电催化活性。同时,阴极修饰后的碳纳米管电极对葡萄糖氧化酶的直接电化学有较好的电催化性能。葡萄糖氧化酶能有效吸附在阴极修饰的CNT表面,实现直接电化学,对葡萄糖有很好的响应。