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启动子是基因表达调控的重要元件,也是基因工程表达载体的一个重要元件。启动子克隆技术包括启动子探针质粒载体筛选启动子和利用PCR技术克隆启动子。绿色荧光蛋白是从多管水母体内发现的,它可以在蓝光或紫外光激发下发射绿光。由于它稳定的结构和光物理性质,又易于在细胞内表达,近些年作为标记物已经被广泛地应用于生命科学领域。本文以质粒pAcGFP为骨架,构建以绿色荧光蛋白为报告基因的启动子探针载体。用一段约700bp的基因片段插入pAcGFP中取代其上的lac启动子,获得中间载体pEH+GFP。人工合成一段特异核糖体结合位点(RBS)序列插入到pEH+GFP中得到载体pEH+GFP+RBS。最终构建成以绿色荧光蛋白为报告基因的启动子探针载体pGFP+RBS,并用它从铜绿假单胞菌的总DNA中成功钓出一段具有启动表达GFP的功能的基因片段,初步分析该片段为组成型启动子。CspA是大肠杆菌中一种主要的冷激蛋白,近来研究人员对其结构、功能和在转录、翻译水平的调控以及mRNA稳定性等方面作了大量研究。本文用PCR技术克隆CspA启动子构建包含CspA冷激启动子的低温表达载体,用以在低温条件下诱导表达目的蛋白。以大肠杆菌DNA为模板,用人工合成引物经PCR扩增获得大肠杆菌冷激蛋白CspA的低温诱导启动子(cold启动子)片段,插入到表达型质粒pET30a(+)的T7启动子片段中,以取代pET30a(+)原有启动子,构建低温诱导表达型载体pET30a/cold。通过克隆表达精氨酸脱亚胺基酶(ADI)来验证pET30a/cold的低温诱导启动子的功能和启动子强度。报告基因ADI蛋白的SDS-PAGE分析,表明pET30a/cold-ADI在低温下的表达效率与pET30a-ADI在37℃IPTG诱导表达效率相近。克隆的Cold启动子片段包含了冷激蛋白cspA的完整的中心启动子,具有在低温下诱导表达目标蛋白的功能。并且,可以达到很高的表达效率,构建的低温诱导表达载体pET30a/cold可以作为一种工程工具为以后科研工作打下基础。