基于酶和核酸适体的生物传感器的研究

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针对恶性肿瘤等疾病早期检测方法操作复杂、价格昂贵、灵敏度与准确性尚需提高的问题,研制基于核酸适体的灵敏、快速、简便、经济的生物传感器用于肿瘤的早期诊断。采用丝网印刷电极、纳米粒子、生物条形码等信号放大技术,制备超灵敏的肿瘤标志物生物传感器,提高检测灵敏度。将纳米技术与DNA适体技术相结合,对电极表面进行修饰,制备成探针,应用于肿瘤标志物抗原的识别。适体能与多种目标物质高特异性、高选择性的结合,利用DNA适体的开关技术,建立了高灵敏度测定小分子化合物和蛋白质的适体生物传感器。本论文共分为五章:第一章,概述了DNA生物传感器的设计原理、分类,介绍了DNA生物传感器的研究现状以及适体传感器的研究进展。第二章,利用丝网印刷技术,将硫堇混合加入油墨中,优化电极制备的温度、固化时间等条件,制备成硫堇掺杂丝网印刷电极。将探针ssDNA固定在该电极上,通过与靶ssDNA及修饰了辣根过氧化物酶(HRP)的信号ssDNA杂交,形成双链结构。利用HPR催化H2O2氧化邻氨基酚(OAP)生成2-氨基酚噁嗪(AP),直接检测靶DNA。检测乙肝病毒B(HBV)基因片断的线性范围为:1.00×10?12 mol·L-1 ~ 1.20×10?11 mol·L-1,检测限为7.8×10-13 mo1·L-1(3σ)。第三章,基于适体的结构从DNA/DNA转变为DNA/目标复合物和适体酶增强化学发光,构建了一种检测凝血酶的高灵敏的光化学传感器。凝血酶适体先固定到磁珠上,之后与血晶素适体杂交。在凝血酶存在下,血晶素适体游离到溶液中并与血晶素特异性结合形成适体酶,该适体酶能增强鲁米诺-双氧水体系的发光。通过检测凝血酶浓度与发光强度之间的关系,得到检测凝血酶的线性范围:5.0×10-12 mo1·L-1 ~ 5.0×10-11 mo1·L-1,检测限为3.1×10-12 mo1·L-1(3σ)。第四章,基于生物条码技术和阳极溶出伏安法(ASV)提出了一种双适体同时检测腺苷和凝血酶的电化学传感器。通过Au-S键在金电极表面固定一条巯基修饰的双适体探针DNA,腺苷适体与其互补链杂交,从而CdS固定到电极表面上。当腺苷和凝血酶分子存在时,适体部分发生弯曲包裹住各自的目标分子形成复杂结构,同时,连接有CdS纳米粒子修饰的金纳米粒子就会从电极表面脱落,进入到溶液中。与此同时,固定到电极表面的凝血酶和凝血酶第二适体特异性作用,从而PbS纳米粒子固定到电极表面。采用阳极溶出伏安法(ASV)对金属硫化物纳米粒子进行测定,溶液中腺苷和凝血酶的浓度与各自对应的金属硫化物的溶出信号成正比。运用该双适体生物传感器得到腺苷的检测线性范围是1.0×10-11 mo1·L-1 ~ 2.0×10-9 mo1·L-1,检测限为8.8×10-12 mo1·L-1(3σ);凝血酶的检测线性范围是1.0×10-12 mo1·L-1 ~ 3.0×10-10 mo1·L-1,检测限为7.6×10-13 mo1·L-1(3σ)。该传感器在生物样品中表现出了良好的选择性和良好的检测能力。结论部分,对全文内容进行了总结。
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