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柑橘全爪螨Panouychus citri(Mc Gregor)是柑橘的第一大害螨,每年大量发生,严重影响柑橘的品质和产量,制约柑橘产业的健康发展。目前对柑橘全爪螨的防治仍以化学药剂为主,然而该螨已对多种杀螨剂产生严重抗性。细胞色素P450(cytochrome P450,CYP450)是生物体内的一类初级代谢和活化酶,在昆虫(螨)对外源物质的解毒代谢过程中起重要作用。大量研究表明,昆虫P450s参与杀虫剂的解毒代谢过程。迄今为止,有关P450s参与柑橘全爪螨对杀螨剂的胁迫响应及介导对杀螨剂解毒代谢反应的研究不多。本学位论文以柑橘全爪螨为研究对象,利用叶碟浸渍法系统监测2016-2019年间我国西南柑橘产区7个柑橘全爪螨种群对哒螨灵抗性水平的基础上,掌握抗性发展动态并提出药剂使用建议。基于转录组测序技术,筛选和挖掘响应哒螨灵胁迫的差异表达基因,聚焦P450基因CYP4CL2,综合运用RNAi、原核表达系统和高效液相色谱(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)等方法和技术,系统解析柑橘全爪螨CYP4CL2响应哒螨灵胁迫的分子机理。研究结果为柑橘全爪螨田间抗药性治理策略的制定提供了科学依据。主要内容如下:1柑橘全爪螨田间种群对哒螨灵的抗性监测采用叶碟浸渍法,系统监测2016-2019年间我国西南柑橘产区7个柑橘全爪螨种群对哒螨灵的抗性水平,发现不同地区的柑橘全爪螨对哒螨灵均产生了不同程度的抗性,且呈逐年上升趋势。其中,安岳、南宁、玉溪和桂林等地的柑橘全爪螨对哒螨灵的抗性已达极高抗水平,抗性倍数均超4000倍。另外,抗性水平表现出地域差异性,南方柑橘产区(南宁、桂林和玉溪)柑橘全爪螨的抗性水平普遍高于四川、重庆地区。2哒螨灵亚致死浓度胁迫后柑橘全爪螨差异表达基因的筛选利用转录组测序技术和差异表达基因的分析方法,注释和鉴定哒螨灵亚致死浓度(LC30)胁迫前后柑橘全爪螨差异表达的基因,共6280个Unigene得到注释。其中226个Unigene差异表达(84个Unigene上调表达,142个Unigene下调表达),筛选出1个上调表达的P450基因CYP4CL2,上调倍数达8.89倍。此外,经哒螨灵胁迫后,AMP脱氨酶(AMP deaminase)、酰基辅酶A:溶血磷脂酸酰基转移酶(acyl-CoA:lysophosphatidylglycerol acyltransferase)和鞘氨醇激酶(sphingosine kinase)等代谢通路基因均显著上调表达。3柑橘全爪螨CYP4CL2对哒螨灵的解毒代谢能力测定通过叶碟介导法,将si RNA递送至柑橘全爪螨体内沉默靶标基因CYP4CL2。RNAi处理24 h后,qPCR检测发现,CYP4CL2表达量显著下调28.7%;CYP4CL2沉默后,以哒螨灵(LC30)处理柑橘全爪螨,与对照相比,死亡率显著提高约25%。采用大肠杆菌原核表达系统表达CYP4CL2与PcCPR的重组蛋白,复性纯化后获得可溶性重组蛋白,并经SDS-PAGE和Western blot检测确认。采用微量滴度酶标板法,以细胞色素C为底物,检测PcCPR重组蛋白的比活力为453.129nmol/mg pro.min-1;通过添加PcCPR重组蛋白,以对硝基苯甲醚为底物,检测CYP4CL2重组蛋白的脱甲基活性为2.905 nmol/mg pro.min-1。进一步利用HPLC分析发现,CYP4CL2重组蛋白不能直接代谢哒螨灵,推测CYP4CL2可能通过其他方式参与柑橘全爪螨对哒螨灵的解毒代谢过程,或通过其他代谢途径保护柑橘全爪螨抵抗哒螨灵的伤害。