鲟形目(Acipenseriformes)鱼类是硬骨鱼纲中唯一现存的大型软骨硬鳞鱼类,具有极高的科学价值和经济价值。受过度捕捞、水利工程建设、栖息地破坏等人类活动的影响,全球27种鲟鱼类中已有25种处于不同程度的濒危状态。为拯救濒危的鲟鱼类,同时满足市场对鲟鱼子酱日益增长的需求,许多国家和地区先后开展了鲟鱼的人工养殖,全球鲟鱼养殖业蓬勃发展。自2003年以来,我国已经成为全球最大的鲟鱼养殖国。然而,随着鲟鱼种质资源的衰退和集约化养殖程度的不断提高,鲟鱼病害问题日益凸显,严重制约着濒危鲟人工保种及鲟鱼养殖业的可持续发展。本文主要针对湖北省3个养殖基地中华鲟(Acipenser sinensis)成鱼和幼鱼爆发的细菌性败血症,开展病原生物学、病理学、致病机制等方面的研究。同时,从健康的中华鲟和长江鲟(Acipenser dabryanus)肠道中分离筛选潜在的益生菌,以期为鲟鱼频发的细菌性疾病的防治提供科学依据。本研究采用的主要方法和得到的主要结果如下:1.2015至2017年间,湖北省3个养殖基地子二代中华鲟成鱼和幼鱼发生了严重的细菌性败血症。采用传统的病原菌分离培养方法,从濒死的中华鲟肝脏和脾脏中分离获得11株优势菌株。根据科赫法则人工感染健康的长江鲟,发现其中9株为致病菌,且从受感染的长江鲟肝脏中再次分离得到相同的病原菌。通过对菌株形态特征,生理生化特征,16S rRNA、gyrB、rpoD基因序列及系统发育树分析,确定9株病原菌均为运动性气单胞菌,且以维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)和嗜水气单胞(Aeromonas hydrophila)为主。另外,观察了长江鲟感染维氏气单胞菌和嗜水气单胞菌后的组织病理变化,并对2种病原菌进行了药物敏感性分析。组织病理学研究表明,长江鲟感染嗜水气单胞菌和维氏气单胞菌后表现出相似的病理特征,即肝脏实质细胞坏死、局灶性出血;脾脏红髓和白髓坏死;肾小球水肿、肾小管上皮细胞凝固性坏死;肠道粘膜脱落、结构完整性被破坏。药物敏感性试验结果表明,嗜水气单胞菌和维氏气单胞菌均对氟喹诺酮类、第三代和第四代头孢类抗生素敏感,而对苯唑西林、氨苄西林、青霉素等抗生素耐药。2.为探究嗜水气单胞菌和维氏气单胞菌对鲟鱼的致病机制,对长江鲟人工感染上述2种病原菌前后的脾脏组织进行转录组学分析。高通量测序共获得410996612条Clean reads,组装成26939820条Contigs,521713条Transcripts,254211条Unigenes。差异表达基因分析表明,嗜水气单胞菌感染组长江鲟的脾脏共有5574个显著性差异表达基因,其中2716个基因上调表达,2854个基因下调表达;维氏气单胞菌感染组长江鲟的脾脏共有1724个显著性差异表达基因,其中835个基因上调表达,889个基因下调表达,两组共有差异表达基因1087个。进一步分析表明,嗜水气单胞菌感染组长江鲟脾脏的差异表达基因主要富集于8条免疫相关的信号通路中,分别是Toll-like受体信号通路、吞噬体、细胞因子与细胞因子受体相互作用、溶酶体、肠道IgA产生的免疫网络、神经活性配体与受体相互作用、单纯疱疹感染和Jak-STAT受体信号通路;维氏气单胞菌感染组长江鲟脾脏的差异表达基因主要富集于5条免疫相关的信号通路中,分别是吞噬体、细胞因子与细胞因子受体相互作用、神经活性配体与受体相互作用、溶酶体和单纯疱疹感染。最后,随机挑选6个免疫相关的差异表达基因(LTBR、MHC2、Integrin、CD40L、V-type ATPase和CDH3)进行实时荧光定量PCR验证,发现荧光定量PCR与转录组分析结果的表达趋势基本一致,从而证明了转录组测序结果的可靠性。3.为探究嗜水气单胞菌感染对长江鲟肠道菌群的影响,采用Illumina Miseq高通量测序技术比较分析了嗜水气单胞菌感染组(患病组)和对照组(健康组)长江鲟肠道菌群的差异。基于Unweighted unifrac距离算法的主成分分析(PCoA)比较健康组和患病组长江鲟肠道菌群的结构差异。结果显示,健康组和患病组长江鲟的肠道菌群分布于不同的聚类群,表明嗜水气单胞菌感染对长江鲟肠道菌群结构造成了明显的改变。进一步分析表明,患病组长江鲟的肠道菌群Alpha多样性指数(Invsimpson index)显著性低于健康组(P<0.05)。群落组成分析表明,患病组长江鲟肠道菌群中梭杆菌门(Fusobacteria)、软壁菌门(Tenericutes)和拟杆菌门(Bacteroidetes)丰度明显高于健康组,而厚壁菌门(Firmicutes)和变形菌门(Proteobacteria)丰度明显低于健康组。最后,对健康组和患病组长江鲟肠道菌群中的差异物种进行组间Wilcox秩和检验分析。结果显示,患病组长江鲟肠道菌群中支原体属(Mycoplasma)的丰度显著性高于健康组(P<0.05),而芽孢杆菌属(Bacillus)的丰度显著性低于健康组(P<0.05)。4.本研究旨在从健康的中华鲟和长江鲟肠道中分离筛选具有益生特性的芽孢杆菌,以增强鲟鱼的免疫力和抗病性。结果显示,从健康的长江鲟肠道中分离获得3株芽孢杆菌(BSth-1、BSth-4和BSth-5);健康的中华鲟肠道中分离获得1株芽孢杆菌(BSth-19)。通过对菌株形态特征,生理生化特征,16S rRNA、gyrB基因序列及系统发育树分析,确定4株分离菌株均为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。为探究分离获得的菌株是否具有饲料添加剂的特性,开展了体外抑菌试验、体外产酶试验、芽孢对肠道内环境(低pH和高浓度胆汁)耐受性试验及动物安全性试验。结果表明,枯草芽孢杆菌BSth-5和BSth-19均可以产生蛋白酶、纤维素酶和脂肪酶,并对4种中华鲟病原菌,即嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌、中间气单胞菌(Aeromonas media)和海豚链球菌(Streptocccus iniae)具有明显的拮抗作用。同时,枯草芽孢杆菌BSth-5和BSth-19能够耐受pH=3.0的酸性环境和5.0%长江鲟胆汁酸环境。动物安全性试验结果表明,枯草芽孢杆菌BSth-5和BSth-19对长江鲟均无致病性。为探究筛选得到的枯草芽孢杆菌对长江鲟生长性能、非特异性免疫反应、肠道消化酶活性及抗病性的影响。将360尾健康的长江鲟幼鱼随机分成3组,每组3个平行,每个平行40尾鱼。对照组(C)投喂鲟鱼基础饲料;试验组T1和T2分别投喂添加了2.0×10~8 CFU/g枯草芽孢杆菌BSth-5和BSth-19的鲟鱼基础饲料,试验期为8周。投喂4周和8周后测定试验鱼的生长性能,结果表明,投喂4周和8周后试验组(T1和T2)的终末体重、增重率、特定生长率与对照组无显著性差异(P>0.05),而存活率均显著性高于对照组(P<0.05)。投喂4周和8周后测定试验鱼的血清免疫酶活性,结果显示,投喂8周后试验组(T1和T2)的总抗氧化能力(T-AOC)、总超氧化物歧化酶(T-SOD)和免疫球蛋白M(IgM)活性均显著性高于对照组(P<0.05)。投喂4周和8周后试验组T1的溶菌酶(LZM)活性显著性高于对照组(P<0.05),而T2组与对照组间无显著性差异(P>0.05)。投喂4周后试验组(T1和T2)的丙二醛(MDA)含量显著性低于对照组(P<0.05)。投喂8周后测定试验鱼的肠道消化酶活性,结果显示,试验组(T1和T2)的肠道蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性均高于对照组,但无显著性差异(P>0.05)。投喂8周后对试验鱼进行嗜水气单胞菌人工感染试验,结果显示,试验组T1存活率最高为66.67%,试验组T2次之为53.33%,对照组为33.33%。5.为探究投喂枯草芽孢杆菌BSth-5和BSth-19对长江鲟肠道菌群的影响,采用Illumina Miseq高通量测序技术对投喂8周后的试验组和对照组长江鲟肠道菌群进行了比较分析。基于Unweighted unifrac距离算法的主成分分析(PCoA)比较试验组和对照组长江鲟肠道菌群的结构差异。结果显示,试验组(T1和T2)和对照组长江鲟肠道菌群分布于不同的聚类群,表明投喂枯草芽孢杆菌对长江鲟的肠道菌群结构造成了明显的改变。进一步分析表明,试验组(T1和T2)长江鲟肠道菌群Alpha多样性指数(Shannon index和Chao index)均高于对照组,且试验组T1与对照组之间存在显著性差异(P<0.05)。群落组成分析表明,试验组(T1和T2)长江鲟肠道菌群中厚壁菌门、梭杆菌门、拟杆菌门的丰度明显高于对照组,而变形菌门的丰度明显低于对照组。最后,对试验组和对照组长江鲟肠道菌群中的差异物种进行组间Wilcox秩和检验分析。结果显示,试验组(T1和T2)长江鲟肠道菌群中潜在致病菌属如气单胞菌属(Aeromonas)的丰度显著性低于对照组(P<0.05),而潜在的益生菌属如芽孢杆菌属(Bacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)和双歧杆菌属(Bifidobacterium)的丰度明显高于对照组。综上所述,本研究首次证实中华鲟频发的细菌性败血症的病原为运动性气单胞菌,且以维氏气单胞菌和嗜水气单胞菌为主,并根据药敏试验筛选出防治中华鲟细菌性败血症潜在的药物;长江鲟人工感染嗜水气单胞菌前后的脾脏转录组分析表明,嗜水气单胞菌可抑制抗原呈递相关因子的表达,并引起宿主细胞的凋亡;通过比较分析健康组和嗜水气单胞菌感染组长江鲟肠道菌群的差异,发现芽孢杆菌可能是长江鲟肠道中潜在的益生菌;随后从健康的长江鲟和中华鲟肠道中分离筛选出具有益生特性的枯草芽孢杆菌BSth-5和BSth-19,分别添加进鲟鱼基础饲料中并投喂长江鲟幼鱼8周后,发现投喂枯草芽孢杆菌可以显著性提高长江鲟的存活率、抗氧化能力、非特异性免疫反应及抗病性;同时,发现投喂枯草芽孢杆菌BSth-5和BSth-19可以提高长江鲟幼鱼肠道菌群中潜在益生菌属的丰度,并显著性降低潜在致病菌属的丰度。