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建立一种高效酵母分泌表达系统对利用酵母生产异源蛋白是十分重要的。在已经建成鹰嘴豆孢克鲁维酵母CBS4857宿主Y179U，载体pUK1、pUKD和pUKD-S的基础上，利用克鲁维酵母菊粉酶基因启动子和终止子作为表达元件，采用酿酒酵母的α因子信号肽作为分泌信号，并以人α-2a干扰素作为试验基因构建了表达质粒pUK1-PIT、pUKD-PIT和pUKD-S-PIT。转化子Y179U/pUK1-PIT，Y179U/pUKD-PIT和Y179U/pUKD-S-PIT成功地分泌表达了人α-2a干扰素，其中转化子Y179U/pUKD-S-PIT具有最高的干扰素表达水平，每毫升发酵上清液可分泌表达干扰素1.3×106IU；经过对培养条件的初步优化，在摇瓶培养条件下干扰素分泌表达量可达到60mg/L以上。
考虑到菊粉酶信号肽能够在克鲁维酵母中有效指导大量的菊粉酶分泌，文献也曾报导该信号肽能够指导异源蛋白分泌表达，我们在天然菊粉酶信号肽编码序列的基础上，通过引入无义突变(将编码缬氨酸的密码子GTT突变为GTG)，从而得到引入限制性酶切位点BclI的菊粉酶信号肽；在此基础上利用pUKD-S载体和克鲁维酵母菊粉酶基因启动子、终止子表达元件构建了干扰素分泌表达质粒pUKD-SI-PIT；该质粒转化鹰嘴豆孢克鲁维酵母Y179U后，转化子也成功地分泌表达了干扰素，但是表达量低于采用α因子信号肽指导分泌表达的转化子；利用上述两种信号肽的表达质粒转化到乳酸克鲁维酵母Y166中得到了类似的结果。此外，在酿酒酵母和毕赤酵母中利用改造的菊粉酶信号肽进行了干扰素的分泌表达尝试，但是均未能检测到分泌表达的干扰素。
利用菊粉酶基因的启动子、终止子作为表达元件，分别利用α因子信号肽、天然的菊粉酶信号肽和改造的菊粉酶信号肽，以pUKD-S载体为基础上构建了三种菊粉酶分泌表达质粒：pUKD-S-αF-PInuT、pUKD-S-CSS-PInuT和pUKD-SI-PInuT，将这三种表达质粒分别转化鹰嘴豆孢克鲁维酵母Y179U和乳酸克鲁维酵母Y166，转化子都能够有效地大量分泌表达菊粉酶，其中带有两种菊粉酶信号肽的表达质粒转化子在分泌表达菊粉酶的能力上明显优于带有α因子信号肽表达质粒的转化子；鹰嘴豆孢克鲁维酵母转化子表达菊粉酶的量明显高于乳酸克鲁维酵母。与此同时，以pHC11和pPIC9K为基础也同样利用不同的信号肽分别构建了用于转化酿酒酵母和毕赤酵母的各三种菊粉酶分泌表达质粒：pHC-αF-PInuT、pHC-I-PInuT、pHC-CSS-PInuT和pPIC9K-αF-PinuT、pPIC9K-CSS-PinuT、pPIC9K-BJ-PinuT。上述两组质粒分别转化酿酒酵母DCO4和毕赤酵母GS115和SMD1168后，实验证实酿酒酵母转化子只分泌表达少量菊粉酶，而毕赤酵母转化子则能大量分泌表达菊粉酶，与鹰嘴豆孢克鲁维酵母转化子分泌表达水平相当，每升发酵液中菊粉酶都可达克级水平。进一步的分析表明在克鲁维酵母和毕赤酵母中分泌表达的菊粉酶与天然表达的菊粉酶糖基化型式相同，均为N-糖基化。
利用KcURA3基因片断，对Y179U进行HIS3基因中断，得到了his3突变株Y179H。Y179H在生长性状上优于Y179U。以Y179H为宿主菌也成功地分泌表达了人α-2a干扰素和菊粉酶，但表达水平没有进一步提高。
总之，通过本研究我们可以得出以下结论：1.我们建立的鹰嘴豆孢克鲁维酵母分泌表达系统，已经成功地分泌表达了人α2a干扰素和菊粉酶，其表达量已经达到很高的水平。因此，鹰嘴豆孢克鲁维酵母分泌表达系统可以认为是一个有潜力的基因工程表达系统。
2.经改造的菊粉酶信号肽能在鹰嘴豆孢克鲁维酵母、乳酸克鲁维酵母、酿酒酵母和毕赤酵母中成功地指导菊粉酶的分泌表达，说明该菊粉酶信号肽具有一定的通用性。
3.鹰嘴豆孢克鲁维酵母和毕赤酵母系统分泌表达菊粉酶的水平已具有明显的开发应用价值。