柠檬酸因其独特的酸爽口味和安全无毒的特性,在食品行业颇受亲睐。不仅如此,柠檬酸在医药、化妆品、化工等领域的应用也颇为广泛,是世界上消耗量最大的有机酸。我国柠檬酸原料来源丰富,生产前景较好,目前已成为世界上柠檬酸最大的生产国和出口国。柠檬酸生产的主要方法是利用黑曲霉液体深层发酵,虽然目前柠檬酸发酵滴度和糖酸转化率均达到较高水平,但是仍有进一步提升空间。因此,构建黑曲霉发酵高产柠檬酸工程菌种显得尤为重要。本文以黑曲霉ATCC1015为初始菌株,利用分子生物学的手段,通过分析三羧酸循环中草酰乙酸水解酶基因(oahA),苹果酸脱氢酶基因(cmdh),丙酮酸羧化酶基因(cpyc),富马酸酶基因(fumr),富马酸还原酶基因(frds)以及EMP途径中的磷酸果糖激酶基因(pfk)对柠檬酸合成的影响,从而构建柠檬酸高产菌株。主要研究结果如下:(1)以实验室构建的表达质粒pLH454为出发载体构建了pfk、fumr、frds的表达载体。(2)农杆菌介导黑曲霉转化,获得oahA敲除菌作为出发菌株,然后分别构建了pfk、fumr、frds、mdh、pyc等过表达菌株。(3)通过摇瓶发酵分析柠檬酸产量,发现单独过表达了pfk、fumr、frds、mdh和pyc基因的过表达菌株与出发菌株相比其产量提高分别为4.16%、4.89%、4.98%、1.17%和1.03%;双过表达fumr和frds基因的菌株比出发菌株提高了 6.13%。(4)提取RNA分析过表达基因的转录情况,异源表达的fumr和frds在黑曲霉中都实现了表达;pfk、mdh以及pyc基因的表达量与出发菌株相比都有不同程度的提高,其中pfk的表达量提高最多为出发菌株S549的3.03倍,mdh和pyc的表达量则分别为出发菌株2.42倍和1.28倍。(5)通过酶学分析发现,与出发菌株S549相比,过表达pfk的菌株S642、过表达mdh的菌株S703、过表达pyc的菌株S706其酶活与出发菌株相比分别提高了1.23、1.59 和 1.34 倍。