研究背景淋巴瘤/白血病是淋巴造血系统的常见恶性肿瘤。在我国恶性淋巴瘤发病率占恶性肿瘤总数3％-4％，居恶性肿瘤第11位。白血病的年发病率2.76/10万，是青少年最常见的恶性肿瘤。基因易位等遗传物质的异常在淋巴瘤/白血病中较常见，提示基因结构和功能的异常在淋巴瘤/白血病的发病机制中可能占有十分重要的地位，淋巴瘤/白血病相关基因的功能研究成为目前研究热点。 近年来MDM2与淋巴瘤/白血病的关系逐渐受到重视。MDM2是一种癌基因，它的蛋白分子结构包含了多个功能结构域，不仅可结合p53蛋白，同时还能与E2F1、Rb等重要基因产物相结合，从而影响细胞周期、细胞增殖和凋亡、应激反应等重要生命过程。MDM2致癌作用包括两方面的机制：抑制p53等抑癌基因的抗肿瘤活性以及直接的致癌作用。MDM2被视为p53最重要的负性调控基因之一，MDM2扩增和(或)过表达导致野生型p53失活，促进肿瘤发生和发展；另一方面MDM2异常可以直接引起正常细胞的恶性转化。研究MDM2及其相关基因对肿瘤防治具有重要的价值。在淋巴瘤/白血病中MDM2主要以过表达形式存在，已往的研究显示MDM2与淋巴瘤/白血病之间存在相关性，但是其中的分子机制仍未被阐明。本实验以石蜡包埋淋巴瘤组织和淋巴瘤/白血病细胞株作为研究对象，通过免疫组化、RT-PCR、Westernblot、RNA干扰等研究方法，初步探讨MDM2与淋巴瘤/白血病相关性及其分子机制。 全文分四部分。第一章MDM2基因及相关基因与非霍奇金淋巴瘤的关系目的回顾性调查MDM2在淋巴瘤中的表达情况，探讨MDM2与淋巴瘤相关性。 方法与结果1收集190例石蜡包埋非霍奇金淋巴瘤组织，光镜下观察每例HE切片典型病变区域，然后在相应蜡块的两个不同位置各选取一块微组织块用于制备组织芯片。经常规染色和免疫组化检测，组织芯片符合实验要求。 2采用免疫组化SP方法，在组织芯片上检测MDM2，p53，p21，Bax，Ki-67共5个指标，发现MDM2在不同类型淋巴瘤阳性率差异很大，在侵袭性淋巴瘤表达较高而在惰性淋巴瘤未检出MDM2；在DLBCL中MDM2阳性率与Bax的表达呈负相关；在ALCL中，MDM2高表达与肿瘤细胞高增殖指数呈正相关；在PTCL中与突变型p53密切相关。 结论本实验结果显示MDM2与侵袭性强，临床预后较差的淋巴瘤类型具有较密切的相关性，提示MDM2可促进淋巴瘤发展，有可能作为评价淋巴瘤恶性程度和临床预后的指标。 第二章RNAi干扰MDM2在淋巴瘤/白血病细胞中的表达目的通过RNAi建立暂时性和稳定性MDM2表达下调的淋巴瘤/白血病细胞系。 方法和结果1构建重组shRNA表达载体从大肠杆菌DH5α提取表达载体pSilencer4.1-CMVneoDNA，经BamHⅠ和HindⅢ双酶切后，与合成的DNA模板链连接，转化大肠杆菌DH5α得到阳性菌落；增菌培养后提取载体DNA进行测序，结果证实表达shRNA的DNA模板链已成功插入载体的正确位置。针对MDM2基因的重组shRNA表达载体命名pMDM2-shRNA，无功能shRNA表达载体命名为pCMV。 2转染和筛选携带重组shRNA表达载体的细胞系瞬时转染采用lipofectamine2000将化学合成的siRNA导入K562和Jurkat细胞；稳定转染采用lipofectamine2000将重组shRNA表达载体转染上述细胞。稳定转染细胞加入G418筛选抗性细胞，10-14d完成筛选。稳定转染细胞的鉴定：扩大培养后抽提细胞基因组DNA，用载体测序引物扩增出相应的±243bp条带；在转染细胞和未转染细胞中分别加入1000μg/mLG4183-6d后，未转染细胞几乎全部死亡，转染细胞无明显细胞死亡；转染细胞用含300μg/mlG418培养基培养2个月，细胞保持稳定增殖。实验证实成功筛选出携带重组shRNA表达载体的Jurkat和K562细胞系。 3MDM2基因表达下调转染化学合成siRNA的细胞培养48h后，收集细胞提取蛋白质进行Westernblot检测，结果显示转染MDM2siRNA的K562、Jurkat细胞株MDM2蛋白表达下降60-70％。 稳定转染的细胞同时提取mRNA和蛋白质进行多重RT-PCR和Westernblot检测。相对于转染pCMV的细胞，转染pMDM2-shRNA的Jurkat细胞经多重PCR结果显示，MDM2mRNA表达下降超过60％，同时Westernblot结果显示MDM2蛋白表达减少55％以上。另一方面，多重PCR和Westernblot结果显示，转染pMDM2-shRNA的K562细胞MDM2表达明显下降，在mRNA和蛋白质水平分别下降70％以上。 结论瞬时转染和稳定转染均能有效干扰MDM2基因表达，表明RNAi是研究MDM2基因功能快速、高效的工具。 第三章MDM2敲低后对淋巴瘤/白血病细胞生物学特性和基因表达的影响 目的探讨MDM2基因表达下调后对细胞生物学特性和基因表达的影响 方法和结果通过测定和比较转染pCMV和转染pMDM2-shRNA细胞的生长曲线，发现转染pMDM2-shRNA的细胞生长减慢，倍增时间延长。分别用70％乙醇固定转染pCMV和转染pMDM2-shRNA细胞，用PI法在流式细胞仪上检测细胞周期，发现转染pMDM2-shRNA细胞的改变主要表现为G1期细胞增加，S期和G2-M期的细胞减少。转染pMDM2-shRNA的K562细胞凋亡明显增加。 提取瞬时转染和稳定转染细胞的总蛋白，用Westemblot检测不同基因的蛋白质表达水平。结果显示随着MDM2基因的表达下调，可导致多个基因表达发生改变。与阴性对照细胞相比，瞬时转染MDM2siRNA的Jurkat和K562细胞中E2F1和p65的表达均有不同程度下降，稳定转染pMDM2-shRNA的Jurkat和K562细胞中，E2F1基因表达明显下降；p65在K562细胞中表达下降明显，在Jurkat细胞中p65轻度下降；K562细胞p21表达增加。 结论MDM2基因表达下调明显影响淋巴瘤/白血病细胞增殖、凋亡等生物学特性以及多种基因表达，提示MDM2有可能作为淋巴瘤/白血病治疗的潜在新靶点。 第四章MDM2表达下调对淋巴瘤/白血病细胞应激反应的影响目的探讨发生DNA损伤和细胞毒性作用时MDM2基因在淋巴瘤/白血病细胞应激反应中的作用。 方法和结果短时间(非致死性)UV照射后，测定细胞生长曲线发现相对于转染pCMV的细胞而言，转染pMDM2-shRNA的Jurkat细胞和K562细胞前3天处于生长抑制状态，直至第4天以后细胞才逐渐恢复增殖活性。长时间UV照射和1μg/mlMTX作用后，用70％乙醇固定细胞后检测细胞的凋亡情况，发现相对于转染pCMV细胞，转染pMDM2-shRNA细胞均出现不同程度的细胞凋亡增加；加入1μg/mlMTX24hr后提取细胞总蛋白，Westernblot检测发现转染MDM2shRNA的K562和Jurkat细胞Rb基因和Bax基因表达水平高于转染pCMV细胞。 结论MDM2表达下调后淋巴瘤/白血病细胞对DNA损伤因子和细胞毒性因子的敏感性增高，提示MDM2基因在淋巴瘤/白血病细胞中可能具有抗损伤和抗凋亡作用。