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背景表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（Epidermal Growth Factor ReceptorTyrosine Kinase Inhibitor,EGFR-TKI）是针对EGFR基因突变的非小细胞肺癌（Nonsmall-cell lung cancer,NSCLC）的分子靶向药物,但其耐药性随着用药时间的增加而逐渐显现。除了经典的降血糖效果外,二甲双胍还被发现对不同恶性肿瘤的发生和发展具有抑制作用。近年来,越来越多研究显示,二甲双胍还可以联合不同的抗肿瘤药物共同发挥抗肿瘤的作用,延缓后者产生耐药的时间,但其作用的强弱仍存在争议。课题组前期研究发现,二甲双胍在抗肿瘤方面发挥作用的强弱,可能是因为环境中葡萄糖浓度的差异。由此推测,NSCLC患者的血糖水平可能影响二甲双胍协同EGFR-TKI药物作用的强弱以及影响后者耐药的产生。目的研究在不同葡萄糖浓度培养条件下,二甲双胍对NSCLC EGFR-TKI耐药细胞生长、糖代谢的影响,进一步探讨其影响EGFR-TKI耐药的可能机制,并以此为NSCLC患者日后出现EGFR-TKI获得性耐药提供治疗新思路。方法1.不同糖浓度下各细胞株的建立及活性检测（1）本实验采用PC-9细胞（EGFR第19外显子缺失突变,EGFR-TKI敏感细胞株）,在低、中、高葡萄糖浓度培养环境下,通过递增gefitinib浓度（0.01μM-0.02μM）,建立了gefitinib耐药株分别命名为PC9Ge/L、PC9Ge/M、PC9Ge/H。并在建立此三组细胞株的同时给予2.5mM、5mM（课题组前期摸索得出浓度）二甲双胍的细胞株分别命名为PC9（G+2.5M）/L、PC9（G+5M）/L;PC9（G+2.5M）/M、PC9（G+5M）/M;PC9（G+2.5M）/H、PC9（G+5M）/H。（2）倒置相差显微镜观察各组细胞的生长状态。（3）CCK-8法检测各组细胞在不同gefitinib浓度作用下细胞活性的百分比,并绘制抑制曲线,计算各组细胞对gefitinib的耐药指数。（4）流式细胞学检测各组细胞的凋亡和周期分布情况。2.对各组细胞的糖代谢作用进行检测（1）ATP检测试剂盒检测各组细胞内ATP的浓度。（2）qPCR实验和Western-Blot方法检测各组细胞糖代谢过程中关键酶的mRNA相对表达水平和PKM2蛋白表达水平。（3）乳酸检测试剂盒检测各组细胞的乳酸含量。3.对各组细胞的IGF-1R信号通路进行检测qPCR实验和Western-Blot方法检测各组细胞IGF-1R、AKT的mRNA相对表达水平以及p-IGF-1R、IGF-1R、p-AKT和AKT的蛋白表达水平。结果1.不同糖浓度下各细胞株的建立及活性检测（1）倒置相差显微镜观察到,培养基糖浓度越低,PC-9细胞（敏感株）在诱导耐药株的同时加二甲双胍改变其细胞形态、抑制其生长速度越显著,且二甲双胍浓度越大其生长速度越慢。（2）抑制曲线以及耐药指数显示,低糖和中糖培养时,二甲双胍延缓细胞耐药,且糖浓度越低、二甲双胍浓度越大此作用越显著。高糖培养时,二甲双胍对EGFRTKI耐药作用不明显。（3）低糖培养时,PC9（G+2.5M）/L和PC9（G+5M）/L组细胞凋亡率较PC9Ge/L组明显升高且二甲双胍浓度越大,凋亡率升高越显著;中糖培养时,PC9（G+5M）/M组细胞凋亡率较PC9Ge/M组升高;高糖培养时,PC9（G+5M）/H组细胞凋亡率较PC9Ge/H组略微升高。低糖和中糖培养时,PC9（G+5M）组G0/G1期细胞占比较PC9Ge组增高,高糖培养时各组细胞周期分布无明显差异。2.各组细胞的糖代谢作用检测（1）低糖培养时,PC9（G+2.5M）/L和PC9（G+5M）/L组ATP浓度比PC9Ge/L组均降低,且二甲双胍浓度越大ATP浓度降低越显著;中糖培养时,PC9（G+5M）/M组ATP浓度比PC9Ge/M组降低;高糖培养时无明显差异。（2）低糖培养时,二甲双胍作用的EGFR-TKI耐药细胞糖酵解关键酶和三羧酸循环的关键酶的mRNA表达水平及PKM2蛋白表达较PC9Ge/L降低;中糖培养时,PC9（G+5M）/M组己糖激酶、磷酸果糖激酶-1和柠檬酸合酶的mRNA表达水平较PC9Ge/M组降低;高糖培养时无明显差异。（3）中糖和高糖培养时,PC9（G+2.5M）和PC9（G+5M）组乳酸浓度较PC9Ge增加,且二甲双胍浓度越大乳酸浓度增加越显著,低糖培养时无明显差异。3.各组细胞的IGF-1R信号通路检测（1）低糖和中糖培养时,二甲双胍作用的EGFR-TKI耐药细胞IGF-1R、AKT的mRNA表达水平较PC9Ge/L组降低;高糖培养时无明显差异。（2）低糖培养时,PC9（G+2.5M）/L组和PC9（G+5M）/L组的p-IGF-1R、IGF-1R、p-AKT、AKT蛋白表达量较PC9Ge/L均降低,且成浓度依赖性;中糖培养时,与PC9Ge/M细胞组相比,PC9（G+2.5M）/M组的AKT蛋白表达量降低,PC9（G+5M）/M组的IGF-1R蛋白表达量降低;高糖培养时无明显差异。结论1.二甲双胍在糖浓度较低的情况下,可抑制NSCLC EGFR-TKI耐药细胞的生长、增殖、糖代谢过程以及IGF-1R信号通路,增强NSCLC细胞对EGFR-TKI的敏感性,延缓其耐药产生的时间。二甲双胍的这些作用会随着环境中葡萄糖浓度升高而减弱。2.二甲双胍在糖浓度较低的情况下,延缓PC-9细胞对EGFR-TKI产生耐药的机制可能与抑制IGF-1R通路的异常激活有关。