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研究背景神经胶质瘤是起源于神经外胚层的中枢神经系统最常见的原发肿瘤。WHO分级Ⅰ～Ⅳ级,级别越高其恶性程度越高。由于神经胶质瘤存在恶性增殖和侵袭强的特点,因此预后不乐观。尽管手术切除并辅以放化疗,但高级别神经胶质瘤5年的生存率不到10%。其恶性增殖与侵袭的分子机制目前尚不完全清楚。Nexilin是1998年Ohtsuka T等人首先报道的,从大鼠的脑组织中分离纯化的,定位于细胞-基质连接处的一个与F-肌动蛋白(F-actin)结合的蛋白。目前,对Nexilin的研究主要集中在心血管系统,在肿瘤组织的表达以及在肿瘤发生发展过程中的作用知之甚少,一些证据已经表明细胞骨架-基质的相互作用参与肿瘤发生发展的过程。Nexilin的同源基因Nelin增加Hela细胞的迁移和黏附,结合Nexilin的结构特征和生物学特征,提示Nexilin很可能参与胶质瘤的进程。更让我们感兴趣的是,我们之前的研究显示肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor,HGF)上调心肌细胞Nexilin表达,这些线索提示,Nexilin很可能在HGF诱导的神经胶质瘤的迁移和侵袭的过程中发挥重要作用。研究目的:1.免疫组化和Western blot检测胶质瘤组织、正常脑组织及胶质瘤细胞的Nexilin表达,分析胶质瘤组织标本中Nexilin表达水平与临床病理参数的关系,为研究Nexilin参与胶质瘤进程及机制提供组织和细胞学依据。2.为下调Nexilin基因表达,构建靶向抑制Nexilin基因的干扰载体。3.通过下调神经胶质瘤A172、U87细胞Nexilin表达,探讨Nexilin表达对神经胶质瘤细胞生长、迁移、侵袭、粘附的影响。4.通过下调神经胶质瘤U251、U87细胞Nexilin表达,探讨Nexilin对HGF诱导的胶质瘤U251、U87细胞迁移和侵袭的影响以及相关的信号通路,寻找Nexilin在胶质瘤进程的作用机制。方法与结果:1.胶质瘤组织和细胞Nexilin表达:(1)应用含192例胶质瘤、8例正常脑组织和8例肿瘤周围组织的组织芯片,通过免疫组化染色观察了 Nexilin在神经胶质瘤组织的表达及分布,染色结果显示Nexilin定位于细胞胞浆,全部208例组织标本染色结果均呈不同程度的阳性反应。(2)将Nexilin表达分为阴性(-)、弱阳性(1+)、阳性(2+)和强阳性(3+)4个等级进行分析,经Mann-Whitney U检验,结果胶质瘤组织Nexilin表达明显高于非肿瘤组织(P<0.001)。胶质瘤Ⅰ级与非肿瘤组织比较尽管Nexilin表达升高,但升高幅度不明显(P=0.079),Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ级胶质瘤Nexilin表达均明显高于非肿瘤组织(P<0.001)。(3)不同级别胶质瘤Nexilin表达具有明显差异(P=0.00l),随胶质瘤级别升高Nexilin表达亦呈升高趋势,其中Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ级胶质瘤组织Nexilin表达均明显高于Ⅰ级肿瘤组织(P分别为0.006,0.001和0.001),但Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ级胶质瘤间比较Nexilin表达差异不明显(P=0.110)。(4)年龄性别与胶质瘤Nexilin表达的关系:男性胶质瘤Nexilin表达与女性比较无显著差异(P-=0.442),50岁以下患者胶质瘤组织Nexilin表达与≥50岁患者比较无显著差异(P=0.400)。(5)各病理组织类型胶质瘤Nexilin表达:4种组织类型Nexilin表达具有明显差异(P=0.008),由高到低依次为,少突星形细胞瘤、胶质母细胞瘤、星形胶质细胞瘤和室管膜瘤。(6)Nexilin在胶质瘤组织的Western blot结果显示,胶质瘤组织Nexilin表达明显高于肿瘤周围组织(P<0.001),这一结果与免疫组化结果一致。(7)胶质瘤细胞系Western blot结果显示,除SHG-44 细胞外,其它 4 种细胞(SH-SY5Y、A172、U251、U87)Nexilin 表达均明显高于正常人星形胶质细胞(P<0.001),本实验后续细胞学实验提供研究依据。2.靶向抑制Nexilin表达的干扰载体的构建:(1)针对人源Nexilin基因(Gene ID:91624)设计并合成4对miRNA寡聚单链DNA,将寡聚单链DNA退火形成双链,插入到pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR载体,构建4个靶向抑制Nexilin表达的shRNA干扰载体,经测序检测重组克隆中所插入的片段序列,结果显示插入的序列片段与设计的序列一致。(2)shRNA载体转染胶质瘤A172细胞,分别收集24h、48h、72h细胞,Western blot检测各组细胞Nexilin的蛋白表达水平,结果质粒Nexilin-shRNA3对Nexilin抑制最明显,24h抑制率超过了 70%,48h以上抑制率超过了 80%。3.Nexilin表达下调对胶质瘤细胞生物学特性的影响:(1)使用shRNA干扰A172和U87的Nexilin表达,结果Nexilin shRNA转染A172细胞48h后与未转染的细胞比较Nexilin抑制率为80%;Nexilin shRNA转染U87细胞48h后与未转染的细胞比较Nexilin抑制率为71%。(2)经鬼笔环肽染色的胶质瘤A172、U87细胞,NexilinshRNA转染后F-actin含量减少,但F-actin分布未发现明显改变。(3)MTT实验检测A172和U87细胞生长的变化,结果Nexilin shRNA转染A172和U87细胞后,明显抑制细胞活力。(4)Transwell检测A172和U87细胞迁移实验,结果shRNA组A172细胞迁移数减少了49.6%,U87细胞迁移数减少了 57.6%;Nexilin下调明显抑制了 A172和U87细胞迁移能力(P<0.001)。(5)Transwell法细胞侵袭的检测结果为,shRNA组A172细胞侵袭数减少了 55.5%,U87细胞迁移数减少了 34.7%,Nexilin下调明显降低了胶质瘤A172和U87细胞迁移能力(P<0.001)。(6)胶质瘤粘附实验结果为,shRNA组A172和U87细胞粘附率分别下降了 38.03%和21.38%,细胞粘附率均明显被抑制(P<0.001)。4.Nexilin表达下调对HGF诱导的胶质瘤细胞迁移和侵袭的影响及相关信号通路的初步研究:(1)用HGF(50ng/mL)诱导的胶质瘤U87细胞,结果Nexilin蛋白表达水平随时间出现升高趋势,24hNexilin蛋白表达水平达到最高水平,与未诱导的对照比较升高3.5倍,Nexilin蛋白表达水平随HGF浓度增加而增加。(2)使用shRNA干扰A172和U87的Nexilin表达,细胞划痕实验检测Nexilin对HGF诱导的胶质瘤U251、U87细胞迁移的影响,结果显示U251和U87细胞shRNA转染组与未转染组比较,进入划线空白处的细胞(HGF处理12h和24h)均明显减少(P<0.001);Nexilin蛋白表达与细胞划痕实验的划痕长度呈明显负相关(U251细胞r=-0.985,P<0.001,n=6;U87 细胞r=-0.976,P=0.001,n=6)。(3)Transwell实验检测Nexilin对HGF诱导的胶质瘤U251、U87细胞侵袭的影响,实验结果表明Nexilin shRNA转染组穿膜的U251、U87细胞数量明显减少(P<0.001)。(4)Western blot检测Nexilin下调对HGF诱导胶质瘤U251、U87细胞下游信号通路的影响:将Nexilin shRNA转染胶质瘤U251、U87细胞48h,HGF处理30min,Western blot检测下调Nexilin表达后,HGF诱导胶质瘤U251、U87细胞Erk、JNK和AKT蛋白及磷酸化变化。结果下调Nexilin表达抑制了胶质瘤U251、U87细胞Erk1/2、JNK(45KD)和AKT(ser473)磷酸化水平,同样下调Nexilin表达也抑制了 HGF 诱导胶质瘤 U251、U87 细胞 Erk1/2、JNK(45KD)和 AKT(ser473)磷酸化水平,前者的实验结果较后者更加明显。提示Nexilin通过调节Erkl/2和AKT(ser473)磷酸化水平来调节胶质瘤细胞迁移和侵袭。结论:1.Nexilin在胶质瘤组织和胶质瘤细胞高表达,随胶质瘤恶性程度增高Nexilin表达亦升高。2.本研究成功构建了有效靶向抑制Nexilin表达的干扰载体。3.Nexilin表达下调明显抑制胶质瘤细胞的生长、迁移、侵袭和粘附。4.HGF诱导胶质瘤细胞Nexilin表达上调;Nexilin参与HGF诱导的神经胶质瘤细胞的迁移和侵袭能力。5.Nexilin通过影响Erkl/2、JNK(45KD)和AKT(ser473)磷酸化参与胶质瘤细胞迁移和侵袭过程。