独一味(Lamiophlomis rotata (Benth.) Kudo)为唇形科独一属植物,收载于《月王药诊》,是藏、蒙、纳西等民族的民间草药,《中国药典》收录其功用为“活血祛瘀,止血镇痛”,独一味的止血镇痛作用是近几十年民间对其应用总结的结果,独一味制剂临床主要用于多种外科手术后的刀口疼痛、出血等疾病的治疗,疗效确切,且安全性好。独一味别名达布巴、吉布孜、达干木、达知合巴等,传统藏医药理论中主要用于“黄水病”的治疗,达布巴的来源有三种：唇形科独一味属植物独一味Lamiophlomis rotata (Benth.) Kudo,唇形科筋骨草属植物美花圆叶筋骨草Ajuga ovalifolia Bur. et Franch.var. calantha (Diels) C.Y.Wu et C.Chen以及玄参科藏玄参属植物藏玄参Oreosolen wartii Hook. f。三种植物均分布在高海拔地区，植物形态相似,易于混淆,不同产地的“达布巴”药材,存在习用名称、药材基源、分布状态等显著差异,独一味与“达布巴”在不同医疗体系功能主治不同,且临床使用量较大,但较少对代用品的进行相关研究,难以确保独一味药材的用药安全规范。目的：为准确鉴别中药材独一味及其习用品,应用ITS2条形码技术对不同产地的40份药材及其习用品进行鉴定研究。采用多种层析手段对进行系统分离的。并选取具有代表性产地来源的独一味样品进行HPLC-DAD-TOF/MS分析,初步鉴定独一味中主要的代谢产物。研究四个主要产地独一味药材差异。采用1H-NMR代谢物组学技术,对不同产地的样品的初生和次生代谢产物进行多变量分析研究。为了进一步发现独一味组成成分药理活性,采用体外活性测试化合物单体的活性。方法：1、广泛收集独一味、美花圆叶筋骨草药材不同产地的40个样品,利用PCR测序法,采用核基因ITS2片段扩增,双向测序样品,CodonCode Aligner拼接序列,数据用MEGA4.0进行分析,构建邻接(NJ)树。2、综合利用硅胶柱层析、反相硅胶和分子排阻色谱法对独一味水提物组成成分进行系统分离,结合UV、MS、1H-NMR和13C-NMR等光谱数据对分离得到的化合物进行结果鉴定；利用HPLC-DAD-TOF/MS联用技术对独一味中化学成分进行了快速定性分析。3、采用1H-NMR代谢物组学技术,检测分析独一味药材中的初生和次生代谢成分,结合主成分分析(PCA)、HCA方法研究甘肃、西藏、青海和四川等主要产地独一味药材代谢成分组成差异；综合利用核磁氢谱化学位移、液质联用保留时间、质荷比等参数发现不同产地独一味药材的主要代谢产物。采用HPLC-DAD定量测定不同产地独一味药材中6个主要次生代谢产物的含量,评价与NMR代谢组学检测的一致性。4、研究独一味对血小板活性功能影响,采用比浊法检测ADP诱导的血小板聚集功能,选择独一味为研究对象,对从独一味中分析发现的一系列主要代谢产物进行分析。结果：1、独一味ITS2序列长度均为219bp,其种内平均K2P(Kimura-2- parameter)遗传距离为0.0197,远小于其代用品的种间平均K2P遗传距离。ITS2序列作为DNA条形码可以方便快捷地鉴别独一味及其代用品,为其种质资源鉴定及临床安全用药提供了重要分子依据。2、对独一味中化学成分进行了快速定性分析,得到各化合物的总离子流图和多级质谱图,从而对各色谱峰进行鉴定。采用Waters Symmetry色谱柱,以甲醇-0.1%甲酸水溶液为流动相进行梯度洗脱,综合各组分在色谱过程中的保留时间、分子离子分、质谱裂解离子碎片数据,结合参考文献数据分析,从药材中的24种化学成分,其中环烯醚萜苷类14个,苯乙醇苷类7个,黄酮类化合物3个。本研究对独一味药效物质基础研究、质量控制及其临床用药具有一定的指导意义。3、检测分析甘肃、青海、西藏产区独一味药材的整体代谢成分,共鉴定出19个代谢产物,其中：9个环烯醚萜苷类,4个苯丙素类,5个糖类和1个脂肪酸类化合物。核磁共振氢谱(1H-NMR)结合模式识别分析,判别出不同产区独一味之间的代谢产物存在显著的差异性。通过PCA载荷图筛查分析发现,甘肃地区的独一味样品中环烯醚萜苷类化合物较青海和西藏独一味样品中高,而苯乙醇苷类化合物较青海和西藏两个产地样品中低；西藏地区样品中苯乙醇苷类化合物在三个区域样品中相对最高。采用聚类分析Hierarchical cluster analysis (HCA)与PCA分析结果相同,其中组间差异最大的为来自西藏的样品,青海与甘肃样品较为接近。HPLC-DAD法显示本文建立的NMR方法与常规分析方法的定量结果基本一致。4、通过研究其对ADP诱导的血小板聚集功能的影响,发现9个化合物均表现有一定的抗ADP诱导血小板聚集作用,抗ADP诱导血小板聚集强度依次为连翘酯苷B>毛蕊花糖苷>Alyssonoside>木犀草苷>7,8-dehydropenstemoside> Phlorigidoside C>山栀苷甲酯>8-O-乙酰山栀苷甲酯。结论：1、独一味与美花圆叶筋骨草和藏玄参的ITS2条形码存在明显的差异,可以作为独一味及其代用品种的特征性条形码,不同产地的独一味样品的ITS2条形码有一定的差异,青海和四川产地样品差异性较小,甘肃产地样品与西藏产地样品差异性较大。2、1H NMR方法的供试品溶液制备和样品测定耗时短,适用性强,重复性好,可快速鉴别不同产的独一味样品组成成分差异,鉴定结果与独一味样品的ITS2条形码NJ树分析结果有较强的相似性,与常规HPLC-DAD分析方法结果基本一致。3、结合1H NMR和TOF/MS代谢组学方法,综合利用核磁氢谱化学位移、液质联用保留时间、质荷比共鉴定出药材中共有9个代谢成分。4、9个化合物均表现有一定的抗ADP诱导血小板聚集作用,独一味“止血祛瘀,活血镇痛”功用的是9个代谢标志物共同作用的结果。创新点：1)本文针对独一味药质量控制和评价方法的局限性,应用DNA条形码技术,采用1H-NMR代谢物组学和LC-TOF-MS技术,从学术思想、研究思路及分析方法等方面探索了藏药独一味品种鉴定、质量评价研究的新模式。(2)本文首次采用ITS2序列的DNA条形码技术鉴定独一味、美花圆叶筋骨草和藏玄参,实验证明ITS2序列可准确区分出独一味及其习用品种的差异,尽管样品来源复杂(包括课题组采集、市场购买,甚至包括不同存放年限),仍然可以通过ITS2序列将独一味与其习用品区分开,相关研究结果应用于《中国药典》独一味药材DAN条形码标准序列。(3)本文通过HPLC-TOF-MS及LC-MSn技术对独一味中三类主要成分：首次总结24个化学成分的质谱裂解规律,环烯醚萜、黄酮、苯乙醇苷类同时进行分离鉴定,比较全面地阐明了独一味的化学组成,为独一味的药效物质基础研究和质量控制奠定了基础。(4)本文首次利用1H-NMR的代谢物组学技术研究不同产地的独一味Lamio phlomis rotata (Benth.) Kudo成分差异和标志性代谢产物差异,鉴定的差异性化学成分可以作为潜在的化学标志物用于独一味不同产地的鉴别,对于独一味药材产地溯源具有一定的指导意义。(5)本文首次发现独一味中9个单体对ADP诱导大鼠血小板聚集有一定的抑制作用,对于合理控制独一味药材质量有一定的参考价值。