活性肽因具有显著的生理活性,如抗氧化作用、抗血栓、抗高血压、降胆固醇、抗癌等,并且来源广泛,已成为当今科学研究的热点。其中,食源性活性肽因其制备工艺简单且安全性高,已经受到越来越多学者的关注。本文研究的小分子活性肽Tyr-Ala(YA)为两种氨基酸——酪氨酸和丙氨酸组成的二肽,是在玉米蛋白酶解液中提取发现的一种单体肽。我们对其体内外的抗氧化活性进行了研究,同时建立了线虫模型和二型糖尿病动物模型,进一步探讨了其抗氧化作用的机制以及抗衰老、治疗糖尿病等相关活性研究。第一部分在对YA的抗氧化活性的体外研究中,我们采用DPPH自由基清除法、ABTS自由基清除法和超氧阴离子清除法等抗氧化性实验进行综合评估YA的体外抗氧化活性。研究发现,YA具有清除DPPH自由基、ABTS自由基和超氧阴离子的能力。由此我们进一步进行了细胞实验,发现YA本身对细胞并无毒性,在细胞受到严重的氧化损伤的情况下,具有保护细胞的功能。然后,我们使用DCFH-DA探针,检测YA对胰岛细胞ROS水平的影响。经过氧化氢处理过的细胞的ROS水平明显升高,在YA作用后ROS水平明显下降。我们又利用Western Blot技术,对细胞内的PI3K-Akt通路与YA之间的关系进行研究。PI3K-Akt是影响体内抗氧化能力的一个重要通路,结果显示在高糖刺激下PI3K和磷酸化的Akt表达均有所下降,在YA干预后,PI3K和磷酸化的Akt表达均明显上升。综上所述,YA对氧化损伤的细胞具有保护作用,能够清除自由基,并且可以调节PI3K-Akt这个通路。PI3K-Akt通路也是影响胰岛素分泌的一个重要通路,因此我们设想,YA是否有促进胰岛素分泌的作用,我们利用胰岛素Elisa试剂盒对胰岛素含量进行检测。结果显示,在高糖的刺激下,INS-1细胞分泌胰岛素水平明显降低,而YA可以促进高糖刺激下的INS-1细胞胰岛素的分泌。第二部分,我们对YA在线虫体内的抗氧化活性进行了研究,建立了氧化应激的线虫模型,并对YA的抗氧化机制进行了探究。研究结果表明,YA在线虫自然生长和在氧化应激条件下,均可使线虫的寿命延长,清除体内过多的ROS,并且通过对CF1553线虫的SOD-3蛋白表达的测定得出,YA是通过对SOD-3蛋白表达的升高起到清除线虫体内自由基的功效,YA还可以调节一些与抗氧化相关基因daf-2和daf-16的表达。第三部分,我们进行了YA在二型糖尿病小鼠体内的研究。我们应用高脂饮食配合STZ注射建立了实验型二型糖尿病小鼠模型,检测小鼠的体重、空腹血糖、胰岛素水平;并进行小鼠的耐糖量测试;利用试剂盒测定小鼠血清中Hb A1c、TC、TG、SOD、MDA、GSH含量;称量小鼠的肝脏、胰腺、脾和肾脏的重量,并利用HE染色法观察胰腺和肾脏的病理形态学改变。实验结果表明,模型组的小鼠的体重变化异常,空腹血糖值升高,胰岛素分泌水平下降,而YA经过尾静脉注射4周的二型糖尿病小鼠,一般形态学状态均好转,促进了胰岛素的分泌。通过对小鼠血清中Hb A1c水平的检测可见,YA有效的降低了Hb A1c的水平。Hb A1c反映了葡萄糖的水平,其升高的原因主要是由于二型糖尿病的血糖持续升高和微血管的损害。Hb A1c水平越高,则导致组织缺氧越严重,使蛋白质结构功能改变,尤其使发生在肾脏微血管丰富的部位,引起肾组织细胞缺血缺氧,导致肾组织损伤。二型糖尿病也常伴血脂异常,它是胰岛素抵抗的始发因素也成为了动脉粥样硬化、高血压、高血脂症等疾病的关键因素。所以改善二型糖尿病小鼠的内脂代谢具有重要意义,并且对糖尿病的恶化或者产生并发症起到缓解作用。YA有效的降低了TC、TG水平,可见YA具有良好的降血脂的作用。YA的抗氧化作用在二型糖尿病小鼠身上也得到了很好的体现,有效升高了SOD水平,降低了MDA含量,促进了GSH的产生。二型糖尿病的β细胞的损伤主要就是通过线粒体氧化使葡萄糖代谢升高和FFA增加,从而升高线粒体膜电位,增加了过氧化物的产生。随着过氧化物的产生增加,导致更多的细胞暴露在ROS下并且激活了解偶联蛋白。所以YA的抗氧化性,可以抑制β细胞的氧化损伤,从而有治疗二型糖尿病的作用。最后,通过对小鼠脏器的研究,发现YA对二型糖尿病小鼠的脏器有一定的修复作用。胰腺内胰岛细胞形态和活性经过YA治疗后有所改善,肾脏皮质损伤得到恢复,肾小球细胞得到治疗。综上所述,我们对YA的抗氧化活性及其机制进行了体内外的研究,并且对二型糖尿病的影响等方面进行了探讨,发现YA在体内外都发挥着很好的抗氧化作用及相关活性功能。在未来的研究中,我们可以进一步对YA的其它相关活性和作用机制进行探索,对二肽YA在未来的应用中起到指导性意义。