元素的生物利用性、代谢过程和毒性等都与其存在形态密切相关。元素形态包括其同位素组成、价态、无机或有机形式以及生物大分子结合形态等。然而,针对生物样品中的元素形态分析,往往会面临样品中元素及其形态含量低、样品基质复杂、样品体积有限以及形态之间易相互转换等难题。因此,生命体系中的元素形态分析已经成为了分析化学研究的热点,所面临的挑战也十分突出。砷是一种广泛存在的元素,在自然界和生命体系中砷形态的种类丰富。洛克沙肿(Roxarsone (ROX))作为禽畜的饲料添加剂已经使用了几十年,在世界范围内的家禽养殖工业中应用广泛。人们对洛克沙胂所引起的砷环境污染、人类健康危害一直存在着担忧。洛克沙胂在家禽体内的代谢并不清晰,尤其是一些研究表明洛克沙胂会被代谢成一些未知砷形态。因此,研究洛克沙胂在家禽体内的代谢途径以评价洛克沙胂的安全性具有十分重要的学术意义和现实意义。为了研究洛克沙胂的毒性,首先需要设计一个项目研究洛克沙胂在鸡体内的代谢情况。这个项目中包含两个品种一共1600只鸡,分为实验组和控制组各800只鸡,喂养周期为35天。本论文报道对其中256只鸡的肝样品进行砷的形态分析。同时还需要一个高灵敏、高选择性的砷形态分析技术。在众多砷元素形态分析方法中,高效液相色谱(HPLC)-电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)/电喷雾串联质谱(ESI-MS/MS)联用技术能够在一次进样后同时得到元素形态的定性和定量信息,成为了砷元素形态分析的重要手段。用这种方法能够对鸡肝中的砷形态进行定量,同时还可以对其进行鉴定,尤其是对一些未知的砷形态。通过细胞毒性实验,能够十分直观地比较不同砷形态之间的毒性差异,并对洛克沙胂代谢产物的毒性进行评价。砷的生物毒性是通过其与生物分子之间作用,造成生物分子结构发生变化,从而导致其生理功能的丧失,通过三价苯胂酸与生物分子的作用,对其生理毒性的机理作了初步的研究。元素通过与蛋白质的相互作用形成的络合物性质稳定,其中元素可以被用作标签,对蛋白质进行定量,已经发展成为元素形态分析的新领域。元素标记蛋白质定量方法可以适用的范围广,有助于阐明许多生理和病理过程,吸引了众多科研工作者的兴趣。目前,已经有一些相关研究报道,元素标记蛋白质定量能够实现蛋白质的完全定量,所使用的元素包括过渡金属元素和镧系元素等。元素标记的方法可以选择的标记物种类丰富,能够同时分析多种目标蛋白质。标记元素的选择基于以下几点：(1)金属离子能够与标记试剂或蛋白质结合牢固；(2)金属离子在样品中的含量低(低的背景值)；(3)金属离子在ICP-MS中的检测灵敏度高、干扰少。基于此,在本论文工作中,Cd、Hg、Pb被用作元素标签,与多种不同的抗体结合,形成的络合物能够特异性地识别抗原,从而实现对抗原的定量,所分析的对象包括了癌胚抗原和多种糖蛋白。这种方法基于标记元素与生物分子间的相互作用,对于进一步研究元素在生命体内的代谢和毒性具有重要的价值。本论文的研究目的是：发展样品前处理方法及HPLC-ICP-MS/ESI-MS联用技术用于鸡组织样品中砷形态分析方法；鉴定洛克沙肿在鸡肝中代谢所产生的砷形态；探讨洛克沙胂在鸡肝中的代谢途径以及其代谢产物的毒性；建立基于元素标记的蛋白质定量分析方法。本论文的主要研究内容包括：1)建立了HPLC-ICP-MS/ESI-MS形态分析方法,对鸡肝萃取液的砷形态进行分析。实验组和控制组中的鸡肝样品经过捣碎处理后,采用酶辅助萃取的方法对鸡肝中的砷形态进行提取,胃蛋白酶在超声辅助下进一步提高了其萃取效率。采用阴离子交换柱对九种砷标准进行分析,在15min内达到基线分离,经HPLC-ICP-MS/ESI-MS分析得到提取液中砷形态的定量和定性分析结果。不同天数采集的鸡肝样品经过ICP-MS检测和ESI-MS鉴定,在鸡肝中检测出了八种砷形态AsB、AsⅢ、DMA、MMA、AsⅤ、3-AHPAA、N-AHAA和ROX。其中3-AHPAA、 N-AHAA是ROX在鸡肝中的代谢产物,文献中尚未有相关报道。2)采用一锅法的方法合成了一种新型的固相萃取材料,并将其用于鸡组织提取液中砷形态的分析。对合成的钛离子亲和整体柱材料进行了优化和表征,考察了材料与砷形态之间的作用能力。通过比较不同砷形态的结构,可以得到材料与砷形态间的作用是通过As-O-Ti的方式。制备的材料在104倍过量的磷酸根离子存在下,依然能够保持对砷形态的良好吸附性能。将该材料应用于不同的样品基质,包括鸡肉、鸡肝、鸡皮和鸡肾等组织提取液中砷形态的分析,结果并未受到影响,说明该材料耐受样品基体干扰能力强。经过固相萃取处理后,在鸡肝样品中低含量的DMA.MMA.As(V).3-AHPAA.N-AHAA和ROX等也能在HPLC-ESI-MS中得到鉴定。3)通过对多种已知砷形态的研究,建立了ESI-MS/MS和ESI-TOF-MS方法,并将其用于鸡肝提取液中未知砷形态的鉴定。在未知砷形态的保留时间处,检测到了子离子碎片中含有m/z of91(AsO-).107(AsO2-)和123(As03-)的母离子,通过进一步的高分辨质谱ESI-TOF-MS鉴定,确认了这三种未知砷形态分析为甲基化的3-AHPAA.甲基化的N-AHAA和甲基化的ROX。这三种甲基化的砷形态从未被报道过,在本工作中首次被鉴定出来。合成了这三种甲基化的砷形态,对鸡肝样品进行加标,确认了上述鉴定结果。为了验证这种甲基化途径,我们用甲基化酶As3MT/wt模拟胞内实验,结果表明了这种转化途径是存在的,因此,我们得到了洛克沙胂在鸡肝中的完整代谢途径。4)将所建立的联用技术方法应用于鸡肝样品中的砷形态分析。对两个品种(Cobb500和Ross308)的鸡肝样品分析结果表明,用药期间(第0天到第28天),ROX在鸡肝中会不断积累,到用药期的最后一天(第28天),ROX含量分别为275.9μg kg-1(Cobb500).318.9μg kg-1(Ross308),明显高出控制组。到了休药期最后一天(第35天),ROX含量分别6.5μg kg-1(Cobb500).10.7μg kg-1(Ross308)。统计学结果表明,实验组中ROX含量的增加与使用ROX喂养相关。总砷含量在第28天达到最大值,分别为1023.8μg kg-1(Cobb500).1309.6μg kg-1(Ross308),到第35天,尽管大部分砷都被排出体外,但实验组中总砷含量207.0μg kg-1(Cobb500).185.9μg kg-1(Ross308)比控制组中总砷含量54.4μgkg-1(Cobb500).46.5μg kg-1(Ross308)要明显高出。这说明了尽管经过一周的排出,仍然有洛克沙胂的代谢产物残留在鸡肝中,其中无机砷含量为19.9μg kg-1。5)研究了洛克沙胂代谢产物中三价苯胂酸对人膀胱癌细胞T24的细胞毒性。用不同浓度的三价苯胂酸来培育T24细胞,检测80h的细胞指数(CI)。当三价砷浓度不断增加时,细胞生长受到了影响,CI逐渐下降。当CI降为零时,3-AHPAAⅢ和ROXⅢ的浓度分别为50μM、0.75μM,也就是认为细胞全部死亡。在24h时,3-AHPAAⅢ和ROXⅢ对T24细胞的半凋亡率ICso分别为21.97μM、0.1929μM。 ROXⅢ比3-AHPAAⅢ表现出了更高的细胞毒性,而与其五价形态ROX(5.7mM)相比,浓度低30000倍。与五价苯胂酸的细胞毒性相比较,顺序为ROXm>3-AHPAAm>3-AHPAA>ROX>N-AHAA。为了研究其产生毒性机理,研究了ROXⅢ与肽段、蛋白质等生物分子的作用。10个ROXⅢ能够结合到一个金属硫蛋白分子上,与无机砷AsⅢ相比,结合反应达到平衡的速率更快。6)建立了一种高灵敏度、高选择性的汞元素标记蛋白质定量分析方法。金属离子Hg通过螯合试剂与抗体相连,特异性地识别样品中的癌胚抗原(CEA)。尺寸排阻色谱(SEC)用于分离过量的标记元素,制备并表征了Hg标记的抗体。经过夹心免疫反应后,对50μL的样品中的CEA进行分析,检出限可以达到0.041ng mL-1,方法的精密度(RSD)为5.2%(c=8ng mL-1,n=7),所建立的磁免疫分析方法的线性范围为0.1-50ng mL-1。将方法应用于三个不同的人血清样品的分析,所得到的结果与临床所用化学发光方法结果吻合良好,说明了该方法能够应用于临床的CEA分析。7)建立了磁免疫分析的方法,同时分析分别用Cd、Hg、Pb标记的三种糖蛋白。负载凝集素的磁球选择性地捕获样品中的结合珠蛋白(HP)、血红素结合蛋白(HPX)和卵清蛋白(OVA),然后与Cd、Hg、Pb标记的对应抗体特异性识别。Cd、Hg、Pb通过与修饰后的聚合物长链结合后标记到抗体上,放大了标记探针的信号。所建立的方法对HP、HPX、OVA的检出限分别为0.032、0.027、0.13ng mL-1,精密度分别为7.4%、6.8%、7.6%(c=5ng mL-1,n=7),线性范围为0.1-100ng mL-1、0.1-100ng mL-1、0.5-100ng mL-1,对实际样品的加标回收率在97.6-105%之间。本工作所建立的方法成功应用到了人血清样品中的三种糖蛋白同时分析。