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苹果是全世界最重要的水果之一。大量的转录组数据分析表明,真核生物基因组中高达90%的DNA被转录,而只有1-2%的转录物有编码蛋白质的能力。这说明大部分真核生物基因组产生的大部分RNA分子没有蛋白质编码潜力,这些RNA分子被称为非编码RNA。长链非编码RNA(Long non-coding RNA,lncRNA)是长度大于200个核苷酸的非编码RNA。随着新一代测序的出现,已在几种植物物种中鉴定出数千种lncRNA,如水稻,拟南芥,玉米,番茄,小麦,苹果,棉花等。大量研究证明植物LncRNA在种子发育,光形态建成,果实发育,microRNA沉默,miRNAharvest前体合成和生物、非生物胁迫反应中起重要作用。本研究拟以红富士苹果为研究材料,探究果实成熟后期lncRNA调控果实着色的分子机制。1.采取采收期前1个月的套袋红富士,进行24 h强光(15000lux,20℃)处理8天,分0,3,5,8天取果皮样品,通过HPLC检测红富士苹果果皮花色素苷含量。结果表明,随着光照天数的增加,苹果着色程度越深,花色素苷含量增加。2.将取样的红富士果皮进行全转录组测序(mRNA,lncRNA,miRNA),进行差异基因分析,结合花色素苷含量变化趋势,进行加权网络共表达分析(WGCNA)。使用psMimic,psRobot软件预测lncRNA与miRNA之间的结合,使用psRNATarget软件预测miRNA与mRNA之间的剪切。结合表达量构建 lncRNA-miRNA-mRNA(MLNC3.2/4.6-miRNA156a-SPL2-like/SPL33)三元调控通路。3.利用RACE试验验证miRNA1 56a与SPL2-like/SPL33之间的剪切关系。利用原位杂交试验检测MLNC3.2/4.6的定位,发现其定位于细胞质。构建表达载体用于瞬时侵染‘斯托拉夫’果实和稳定转化王林愈伤组织。结果显示,过表达MLNC3.2/4.6和SPL2-like/SPL33可以促进花色素苷积累,过表达miR156a则花色素苷积累减少,VIGS瞬时沉默试验也获得了相反的结果。4.为了验证是光质对上述通路调控机理,对摘袋苹果果实分别进行红光、蓝光和紫外线三天持续光照处理,进行花色素苷含量和qRT-PCR检测。发现蓝光处理下MLNC3.2/4.6可以与miRNA156a结合,进而防止miRNA156a剪切SPL2-like/SPL33,促进花色素苷的积累。红光处理下MLNC3.2/4.6与miRNA156a结合下降,大量miRNA156a剪切SPL2-like/SPL33,抑制花色素苷的积累。紫外线处理下,果实会出现明显着色,但不经过此调控通路。综上所述,miRNA156a会随光照时间的增加表达量显著上升,而其靶向剪切的SPL2-like和SPL33并没有随miRNA156a表达量的上升而下降。分析发现光可以诱导两个lncRNA(MLNC3.2/MLNC4.6)结合miRNA 156a进而减少其对SPL2-like和SPL33的剪切。