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猪流行性腹泻病(PED)是由病原体猪流行性腹泻病毒(PEDV)感染引起的严重危害养猪业发展的肠道疾病,导致感染猪脱水、腹泻和呕吐,尤其对哺乳期的仔猪危害最大,发病率和死亡率极高,严重制约全球养猪业的发展。但到目前为止,针对PEDV全球性暴发尚无有效的应对措施,仅仅依靠缓解症状的药物和疫苗来预防和控制,效果并不理想。因此,寻找出有效的抗PEDV药物成了预防和控制PEDV的关键步骤。以往研究表明,PEDV既可以在加有胰酶的猴肾细胞(Vero)系中高效繁殖,也可以在宿主靶细胞猪小肠上皮细胞(IEC)中繁殖,且均能产生明显的细胞病变(CytopathicEffect,CPE),因此,Vero细胞与IEC细胞可作为筛选具有抗PEDV的目的基因的理想细胞系。本研究旨在利用慢病毒等相关技术构建外周血单核细胞(PBMC)的免疫纳米抗体库,来寻找具有抗PEDV作用的基因。通过SMART技术获得的VHHs文库连接到慢病毒表达载体上,将包装质粒与慢病毒其他三个辅助质粒共同转染293T细胞,从而获得具有感染性的慢病毒文库,通过此文库感染Vero细胞与IEC细胞,构建稳转细胞系,并用PEDV病毒对此细胞系进行筛选,获得具有抗PEDV效应的活细胞,通过RT-PCR测序获得目的基因,NCBI数据库中BLAST分析,进而获得我们所需要的具有抗PEDV病毒的基因。具体研究内容与获得结果如下:1.慢病毒表达载体的改造。以pFPAV3-CcdB-Cm作为模板扩增致死基因CcdB-Cm,设计引物在CcdB-Cm片段上下游分别添加XbaI,BgLII酶切位点,与经Xba I和BamH I酶切pCD513B-1产物进行连接,获得构建VHHs文库用的慢病毒表达载体pCD513B-1-CcdB-Cm。经检测,pCD513B-1-CcdB-Cm经XbaI和Not I酶切,获得8100bp和1400 bp大小的特异性片段,表明载体构建成功。克隆效率检测结果发现,改造后的pCD513B-1-CcdB-Cm慢病毒表达载体与商品化慢病毒表达载体pCD513B-1相比,显著提高了VHHs的克隆效率。2.慢病毒纳米抗体免疫文库的获得。利用SMARTer TM技术,成功构建慢病毒纳米抗体免疫文库,经检测该慢病毒纳米抗体免疫文库的转化效率为7.26×106 cfu/3μg、文库丰度为1.97×109 cfu/m L,重组率95%以上,符合文库构建需要。该方法为纳米抗体在真核细胞中的高通量筛选提供了新的技术平台。3.稳定表达VHHs蛋白的IECs,Vero细胞系的构建。将筛选的重组慢病毒载体质粒与另外三个包装质粒pLP1,pLP2,p LP/VSVG共转染293T细胞,获得具有感染性的重组慢病毒,病毒滴度均超过1.0×10~7 TU/ml。使用该慢病毒感染Vero和IEC细胞,荧光显微镜检测发现该慢病毒的感染率达到50%左右。用嘌呤霉素处理感染后的细胞,Western blotting检测证实成功获得可以稳定表达VHHs蛋白的IECs,Vero细胞系。4.抗PEDV目的基因的筛选及其功能验证。利用猪流行性腹泻病毒CV777毒株分别感染可以稳定表达VHHs蛋白的IECs细胞系和Vero细胞系,最终只有稳定表达VHHs基因的IEC细胞存活下来,通过提取RNA、反转录、PCR、测序等手段获得目的基因VHH-P,从测序结果正确的VHH-P中随机挑选VHH-P2、VHH-P6两个基因进行抗PEDV功能的验证。结果表明:过表达VHH-P2、VHH-P6蛋白可以使感染了CV777毒株的Vero细胞CPE出现的时间推迟,病毒滴度降低,表明VHH-P2、VHH-P6基因对CV777病毒的增殖具有抑制作用。Western blotting结果证实IEC细胞中过表达VHH-P2和VHH-P6蛋白,PEDV N蛋白的表达量相对减少,与病毒滴度结果降低的结论一致。