背景与目的急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)是发生于造血干/祖细胞的恶性增殖性疾病,主要以大量的白血病细胞在骨髓等造血组织中增殖、积聚,抑制正常造血功能,并向髓外组织侵犯形成浸润病灶为特征。白血病的发生率及死亡率呈逐渐上升趋势,我国白血病的年发生率为5.68/10万,在恶性肿瘤中排第17位,死亡率在肿瘤中排第8位。当前随着化疗方案的改进,50～85%的患者经标准方案诱导化疗可获得完全缓解(complete remission,CR),但不少患者会出现复发并进展为难治性白血病导致死亡,而临床上伴有髓外浸润(extramedullary infiltration, EMI)患者对化疗的反应较差、复发风险高,是引起难治性白血病的重要因素之一。如同恶性肿瘤细胞的侵袭和远处转移,白血病细胞向髓外组织侵犯的过程也是一个多因素参与、多步骤完成的复杂过程。多数学者认为处于骨髓微环境中的白血病细胞表面黏附因子表达异常,导致细胞的黏附能力下降或迁移能力增强,从而使白血病细胞从骨髓逃逸到外周血,而后在趋化因子的作用下进行趋化运动黏附在血管内皮上,并分泌细胞基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinases, MMPs)降解细胞外基质,进而迁移到髓外组织定居形成浸润病灶。本课题组前期研究结果显示,在AML1/ETO阳性AML患者骨髓细胞中APP高表达组患者的EMI发生率显著高于低表达组,且APP高表达与不良预后相关；在体外沉默Kasumi-1细胞APP基因表达后,APP基因表达水平明显减少,同时细胞的迁移和侵袭能力均显著下降,进一步研究发现APP通过调控p-ERK/c-Myc/MMP-2通路影响白血病细胞的迁移能力,进而参与白血病细胞EMI的过程。CXCR4作为趋化因子受体,其配体CXCL12主要由骨髓基质细胞分泌,通过二者形成的CXCR4/CXCL12生物轴发挥生物学作用,大量的研究显示CXCR4在多种白血病细胞表面均阳性表达,且CXCR4表达与造血干细胞归巢与动员、EMI及对化疗药物耐药密切相关。EZH2作为PcG蛋白家族成员,具有组蛋白甲基转移酶活性,通过甲基化修饰组蛋白而发挥转录抑制作用,进而导致肿瘤的发生。研究表明EZH2在肿瘤中过表达与患者不良预后相关,还可以通过促进上皮细胞间质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)、分泌MMPs和激活Wnt通路等途径促进肿瘤细胞的侵袭和转移,而目前尚无EZH2在白血病细胞EMI中作用的研究。因此本课题以AML为研究对象,首先采用免疫组化技术检测AML患者组织中APP、CXCR4、EZH2蛋白的表达情况,并分析其临床意义,旨在验证APP、 CXCR4在EMI中的作用,并初步探究EZH2在EMI中的作用；随后采用qRT-PCR方法检测AML患者骨髓单个核细胞EZH2基因表达水平,重点分析其表达与EMI的关系；最后AML细胞株为研究对象,在体外探究EZH2表达对细胞迁移能力的影响。对象与方法1.AML患者骨髓及髓外浸润组织中APP、CXCR4及EZH2蛋白表达及其意义应用免疫组织化学方法,对来源于38例AML患者的23例骨髓组织标本和15例髓外组织标本,分别进行APP、CXCR4及EZH2蛋白水平的检测,并分析其表达与临床表现的关系。5例ITP患者为对照组。2.EZH2基因表达水平与临床特征的关系应用qRT-PCR方法检测42例初发AML患者骨髓单个核细胞中EZH2mRNA的表达水平,并分析其表达与临床特征的关系。10例正常供者为对照组。3.AML患者骨髓EZH2表达水平对治疗反应及预后的影响将有骨髓组织标本或骨髓单个核细胞标本的两部分患者临床资料进行整合,分析EZH2在骨髓中表达与治疗反应及预后的关系。4.EZH2在AML细胞株中的表达与迁移能力分别应用qRT-PCR和Western-blot方法检测4种AML细胞株(包括：U937、HL-60、KG-1α和Kasumi-1) EZH2mRNA和蛋白表达水平,Transwell小室迁移实验反应上述4种细胞株的迁移能力。5.统计分析方法用SPSS13.0软件进行统计分析。APP、CXCR4、EZH2蛋白表达水平用阳性率表示,分析不同组间蛋白表达阳性率差异选用四格表或RxC表资料的χ2检验。由于WBC、LDH、外周血原幼稚细胞比例及骨髓原幼稚细胞比例均不符合正态分布,选用非参数Mann-Whitney秩和检验,结果用平均秩次表示。EZH2基因表达水平均用2-△CT表示,EZH2mRNA经乘以10000取lg数据转换后符合正态分布,Levene’s检验方差齐性。两样本均数比较选用t检验,多个样本均数比较选用单因素方差分析(One-Way ANOVA),数据结果均用x±s表示。相关分析选用Pearson相关或Spearman秩相关,Kaplan-Meier法进行生存分析。p<0.05认为差异有统计学意义。结果1.AML患者骨髓及髓外浸润组织中APP、CXCR4及EZH2蛋白表达及其意义(1)APP和CXCR4均为膜蛋白,阳性表达主要位于细胞膜和部分胞浆；而EZH2为细胞核蛋白,其阳性表达主要表现为细胞核被染成棕黄色。APP、CXCR4及EZH2蛋白在AML组织中表达阳性率分别为50.0%、31.6%、61.2%,均明显高于5例ITP对照组(0.0%、20.0%、20.0%)。(2)38例患者组织中13例M1/M2亚型患者APP表达阳性率为76.9%,18例M4/M5亚型阳性率为38.9%,7例其它类型(包括4例未定型AML和3例肉瘤)阳性率为28.6%,不同亚型之间表达阳性率有显著性差异(P=0.045),即M1/M2亚型阳性率显著高于M4/M5亚型(P=0.036),其它组之间比较无统计学意义(P>0.05)；APP蛋白在外周血原幼稚细胞比例≥40%组阳性率为65.0%,而在<40%组阳性率仅为29.4%,两组之间有显著性差异(P=0.031)；同时LDH升高组APP蛋白表达阳性率显著高于正常组(61.5%vs29.4%；P=-0.026)。另外23例骨髓组织标本中12例伴有EMI,且该组APP阳性率为75.0%,明显高于无EMI组36.4%,但两组之间的差异无统计学意义(P=0.062,接近于0.05)。除上述指标外,APP蛋白表达与性别、年龄、WBC、骨髓中原幼稚细胞比例及复杂核型等均无相关性(P>0.05)。(3)CXCR4蛋白在LDH升高组阳性率为42.3%,正常组中为0.0%,两组之间有显著性差异(P=0.039)；CXCR4在外周血原幼稚细胞比例≥40%组阳性率有明显高于<40%组的趋势,但无显著性差异(45.0%vs17.6%,P=0.077)。23例骨髓组织中,CXCR4在12例伴有EMI组表达阳性率为75.0%,显著高于无EMI组为(27.3%,P=0.022).CXCR4蛋白表达与性别、年龄、FAB分型、WBC及核型等均无显著相关性(P>0.05)。(4)EZH2蛋白在AML组织阳性表达与外周血原幼稚细胞比例(85.0%vs35.3%,P=0.002)具有显著相关性,还与WBC≥10x109/L密切相关(77.3%vs43.8,P=0.034)。另外在23例AML骨髓组织中,EZH2在伴有EMI组表达阳性率也显著高于无EMI组(100.0%vs27.3%,P=0.000),除此之外,EZH2表达与性别、年龄、FAB分型、LDH及复杂核型等均无显著相关性(P>0.05)。(5)APP、CXCR、EZH2三种蛋白在AML组织中表达之间均呈显著正相关,APP与CXCR4、EZH2的相关系数分别为0.453(P=0.006)、0.436(P=0.008),而CXCR4与EZH2之间的相关系数为0.402(P=0.015)。2.AML患者骨髓单个核细胞中EZH2基因表达水平与临床特征的关系(1)所有进行qRT-PCR样本的A260/A280比值均在1.80～2.00之间,说明RNA纯度满足实验要求。目的基因和内参基因的熔解曲线显示显示单一峰,表明cDNA的解链温度均一致,且曲线峰形锐利,提示引物的特异性较高；扩增曲线的重合性及平行性较好,表明实验结果稳定可靠。(2)42例AML患者骨髓细胞EZH2mRNA表达水平为1.69±0.72,10例正常对照组为0.88±0.66,统计分析表明AML患者骨髓细胞EZH2基因表达显著高于对照组(P=0.002)。男性患者EZH2mRNA表达水平为1.94±0.66,女性患者为1.38±0.68,男性患者中EZH2基因表达显著高于女性(P=0.010)；EZH2mRNA在外周血原幼稚细胞比例<60%组表达水平为1.36±0.69,明显低于≥60%组(1.93±0.66, P=0.012); EZH2mRNA在≥35×109/L组为1.92±±0.68,显著高于WBC<35×109/L组(1.43±0.76,P=0.045)。伴有EMI组EZH2表达水平为2.04±0.59,而无EMI组为1.29±0.72,EZH2在伴有EMI组表达显著高于无EMI(P=0.001),提示EZH2表达与EMI发生密切相关,EZH2可能参与白血病细胞由骨髓向髓外组织迁移的过程。将患者按染色体核型预后分层进行分组,低危组EZH2表达为1.00±0.05,中危组为1.94±0.60,高危组为1.844±0.64,统计分析显示中危组表达水平显著高于低危组(P=0.038),而其他组间比较无统计学差异(P>0.05),提示EZH2有可能成为评估预后的指标之一。相关性分析显示,EZH2mRNA表达水平与PB%和WBC计数均呈显著正相关,但相关系数分别为r=0.404和r=0.374(P<0.05)。EZH2mRNA与FAB分型、年龄、骨髓原幼稚细胞比例、LDH水平、复杂核型均无关(P>0.05)。3.AML患者骨髓EZH2表达水平对治疗反应及预后的影响将有骨髓组织标本或骨髓单个核细胞标本的65患者进行合并,其中55例接受化疗并完成随访的患者纳入分析,中位随访时间454(2～2867)天,同时将EZH2mRNA高于中位数或EZH2蛋白阳性定义为高表达,EZH2mRNA低于中位数或EZH2蛋白阴性定义为低表达。EZH2高表达组1疗程和2疗程CR率分别为56.2%和96.3%,而低表达组分别为30.4%和72.7%,两组间的1疗程及2疗程CR率均无显著性差异(P>0.05)。高表达组有46.2%的患者在首次获得CR的6月内复发,而低表达组仅有16.7%的患者复发,两组之间复发率有显著性差异(P=0.042)；在随访至12个月时,高表达组的复发率达61.5%,而低表达组仍仅有16.7%(P=0.003)。随访至1年时,两组患者的OS率之间无明显差异(P>0.05),但是高表达组患者的RFS率显著低于低表达组患者(38.5%vs83.3%,P=0.003)；当随访至2年时,两组患者之间的OS率及RFS率均无显著性差异(P>0.05)。4.EZH2在AML细胞株中的表达与迁移能力的关系(1) EZH2mRNA在U937、KG-1α、Kasumi-1、HL-60细胞中表达水平分别为0.042±0.034、0.061±0.034、0.114±0.015、0.136±0.033,统计分析显示U937和KG-1α细胞中EZH2基因表达水平显著低于Kasumi-1和HL60细胞(P<0.05),而U937和KG-1α之间、Kasumi-1和HL60之间的EZH2mRNA表达水平均无显著性差异(P>0.05)；Western-blot结果表明EZH2蛋白水平也有同样的结论(2) Transwell实验结果显示,U937和KG-1α下室细胞数分别为3.78±2.11x104、5.00±2.52x104,两组均显著低于Kasumi-1组(8.06±2.19x104)和HL-60组(9.28±1.95x104)(P<0.05),提示前两者细胞的迁移能力明显弱于后两者。结论APP、CXCR4、EZH2蛋白在AML患者中的表达与EMI密切相关,且三种蛋白之间均互相伴随表达；EZH2在AML细胞株中的表达与细胞的迁移能力密切相关；EZH2有望成为疾病复发的指标之一。