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第一部分小鼠DOCK5真核表达载体的构建及DOCK5基因敲除小鼠的鉴定 目的：构建基于小鼠的DOCK5真核表达载体并鉴定DOCK5基因敲除小鼠模型，为下一步研究DOCK5基因对脂肪转化的作用提供实验条件。 方法：针对小鼠DOCK5基因序列设计合成引物序列，载体为pCDNA3.1（+）,构建pCDNA3.1-DOCK5过表达质粒。转染诱导分化成熟的小鼠3T3-L1细胞，运用荧光定量PCR技术筛选出最佳的质粒转染配比，并通过Western blot技术对DOCK5重组质粒的过表达效率进行验证。DOCK5基因敲除小鼠经杂合子交配繁殖，新生鼠4周龄后剪取尾部末端进行鼠尾鉴定，直接提取小鼠全基因组DNA进行半定量PCR，产物经琼脂糖凝胶电泳，通过观察电泳条带确定纯合子小鼠编号及数量。 结果：成功构建了pCDNA3.1-DOCK5过表达质粒，其脂质体与质粒比为1:4为质粒最佳转染浓度比例。小鼠3T3-L1前脂肪细胞的诱导分化成功，重组质粒转染细胞后DOCK5基因mRNA的表达显著高于空载质粒对照组约26.5倍。经过约6个月重复培育鉴定，DOCK5基因敲除小鼠纯合子比例维持在约40%。 结论：成功构建DOCK5过表达载体，筛选出效果最佳的转染比例，并构建DOCK5基因过表达脂肪细胞模型。稳定繁育并正确鉴定出足量的DOCK5纯合子基因敲除雄性小鼠。 第二部分 DOCK5基因对小鼠白色脂肪棕色化的影响 目的：建立DOCK5基因敲除小鼠的脂肪转化模型，探讨DOCK5基因对白色脂肪棕色化的影响。 方法： DOCK5基因敲除小鼠通过不同饮食条件喂养，应用小动物 mic-CT技术检测棕色脂肪分布，分组干预处理后处死小鼠，提取脂肪组织，通过实时荧光 PCR技术检测脂肪转化相关指标的 mRNA水平变化，组织脂肪转化相关蛋白及相应经典信号通路的表达应用Western blot法检测。 结果：小动物mic-CT结果显示，DOCK5基因敲除小鼠背部棕色脂肪组织含量远远小于C57对照组。在DOCK5基因敲除小鼠的白色脂肪组织中，普食组棕色脂肪标志基因UCP-1、P2RX5和Prdm16 mRNA表达下降（P<0.01），Cidea mRNA表达升高（P<0.01），UCP1、PKCδ、PPAR-γ和P-STAT3蛋白表达水平降低（P<0.01），CD36和PKCα蛋白表达水平升高（P<0.01）；高脂组棕色脂肪标志基因UCP-1和P2RX5 mRNA表达下降（P<0.01），Cidea和Prdm16 mRNA表达升高（P<0.01）， UCP1、PKCα、CD36、PPAR-γ和P-STAT3蛋白表达水平降低（P<0.01），PKCδ蛋白表达水平升高（P<0.01）。在DOCK5基因敲除小鼠的棕色脂肪组织中，普食组棕色脂肪标志基因UCP-1、P2RX5、Cidea和Prdm16 mRNA表达下降（P<0.01）；高脂组棕色脂肪标志基因UCP-1、Cidea和P2RX5 mRNA表达下降（P<0.01），Prdm16 mRNA表达升高（P<0.01）。在DOCK5基因敲除小鼠白色脂肪组织中，普食组UCP1蛋白表达水平在罗格列酮刺激下降低（P<0.01），在低温刺激下升高但无明显统计学差异， mTOR/Raptor通路在罗格列酮和低温刺激下激活（ P<0.01）， ERK/PPAR-γ通路在罗格列酮刺激下激活（P<0.01），在低温刺激下表达升高，但无显著的统计学差异；高脂组UCP1蛋白表达水平在低温刺激下升高（P<0.01），在罗格列酮刺激下升高但无明显统计学差异， mTOR/Raptor通路在罗格列酮和低温刺激下激活（ P<0.01）， ERK/PPAR-γ通路在罗格列酮刺激下激活（P<0.01），在低温刺激下表达升高，但无显著的统计学差异。 结论：UCP1是本研究的特异性指标；DOCK5基因表达的多寡直接关系了UCP1的表达水平，且成正相关；DOCK5基因表达减少可加重脂质沉积作用，导致棕色脂肪分化减少，向白色脂肪发育，阻碍白色脂肪向棕色脂肪转化，抑制正常饮食状态下的低温信号传导。 第三部分 DOCK5基因对脂肪细胞白色脂肪棕色化的影响 目的：在DOCK5基因过表达及表达抑制的细胞模型基础上，探讨DOCK5基因对白色脂肪-棕色脂肪转化的影响。 方法：3T3-L1细胞转染pCDNA3.1-DOCK5过表达质粒，细胞脂肪转化指标的mRNA水平变化采用实时荧光PCR技术检测，脂肪细胞甘油三酯含量变化用油红O染色检测，Western blot法及细胞免疫荧光法检测细胞脂肪转化相关蛋白及相应经典信号通路的表达。DOCK5基因敲除小鼠原代脂肪细胞培养，应用实时荧光PCR技术检测细胞脂肪转化指标的mRNA水平变化。 结果：在DOCK5过表达的3T3-L1细胞中，DOCK5过表达组比空载对照组在棕色脂肪标志基因UCP-1 mRNA表达升高（P<0.01），UCP1和PPAR-γ蛋白表达水平升高（ P<0.01）， CD36蛋白表达水平下降（P<0.01）。在DOCK5过表达脂肪细胞中，DOCK5过表达组比空载对照组UCP-1 mRNA在罗格列酮和低温刺激下表达亦升高（P<0.01）， UCP1蛋白表达水平低温刺激下升高（P<0.01），在罗格列酮刺激下无变化；细胞免疫荧光检测显示，UCP1蛋白表达水平在罗格列酮刺激下无变化，在低温刺激下升高（P<0.01）；mTOR/Raptor通路在罗格列酮和低温刺激下激活（P<0.01），ERK/PPAR-γ通路在罗格列酮刺激下激活（P<0.01），在低温刺激下表达降低（P<0.01）。油红O染色显示甘油三酯积累程度无明显变化。细胞免疫荧光显示随DOCK5基因表达增高， UCP1表达增高。在原代脂肪细胞中，棕色脂肪标志基因UCP-1 mRNA表达下降（P<0.01），并随DOCK5基因表达增高，UCP1 mRNA表达增高。 结论： UCP1的表达与DOCK5表达水平直接相关，随其升降而增减。DOCK5是白色脂肪棕色化的关键作用因子，除了可以直接影响UCP1的表达，也可通过负反馈调节罗格列酮刺激介导的ERK/PPAR-γ通路和正向调节低温刺激介导的mTOR/Raptor通路对UCP1的表达进行调控，进而影响脂肪转化的效率。 第四部分 DOCK5基因影响白色脂肪棕色化的作用机制 目的：通过对 UCP1蛋白及启动子结合区域的检测，进一步明确DOCK5基因对脂肪细胞脂肪转化的影响机制。 方法：运用细胞免疫荧光法检测 DOCK5蛋白表达部位，应用免疫共沉淀技术检测与 DOCK5基因直接作用的脂肪转化相关蛋白UCP1的表达，预测软件预测 DOCK5基因对UCP1基因启动子的调控作用及结合位点。 结果：细胞免疫荧光检测显示DOCK5蛋白在脂肪细胞核内表达。免疫共沉淀检测显示DOCK5蛋白与UCP1蛋白的表达呈正相关，二者存在蛋白层面上的直接相互作用。启动子预测显示DOCK5基因调控UCP1基因启动子的结合区域可能位于UCP1基因启动子-112至-117之间，结合位点可能为作用元件NFE2。 结论：DOCK5基因可能通过调控UCP1启动子上游NFE2元件，直接调控UCP1的表达，进而影响白色脂肪-棕色脂肪的转化。