硅对芍药花茎强度的调控及PlHCT1基因功能研究

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芍药(Paeonialactiflora Pall.)是我国的传统名花,因其花大色艳、花型别致、花香浓郁而深受人们的欢迎。现如今,芍药已由最初的庭院栽培、园林观赏拓展到切花生产。作为国际市场上新兴的高档切花,花茎挺直程度是衡量芍药切花品质的重要指标之一。但在生产中,我们发现芍药花朵硕大而花茎强度不足易致花茎弯曲、花朵下垂,这严重影响了芍药切花品质,降低其商品价值。因此,寻找合适的方法来提高芍药花茎强度进而改善花茎挺直程度显得至关重要。硅有益于植物生长发育,在调控植物茎秆强度以及抗倒伏方面发挥着积极作用。前期研究初步明确了硅能够增强芍药花茎强度,但关于硅调控芍药花茎强度的具体机制还不清楚。为了进一步阐明硅对芍药花茎强度的调控作用,本研究采用硅酸钠溶液对芍药进行叶面喷施,进而观测了花茎形态、木质部次生细胞壁、木质素分布与结构以及木质素生物合成酶活性,并且比较了不同花茎挺直程度芍药品种的花茎强度、硅和木质素含量;在此基础之上,开展了硅增强芍药花茎强度的转录组学研究,筛选硅调控芍药花茎强度形成的候选基因;进一步对候选基因PlHCT1进行了克隆,并通过对PlHCT1基因进行超表达和沉默来鉴定基因功能。主要结果如下:(1)硅处理显著增强了芍药花茎强度、改善了花茎挺直程度。花茎解剖结构观察发现,硅处理显著增加了芍药花茎木质部次生细胞壁厚度、加厚的次生细胞壁层数、木质素沉积与分布范围。此外,硅处理还显著提高了芍药花茎中硅和木质素含量,并且多个木质素生物合成相关酶活性增强,包括苯丙氨酸解氨酶(PAL)、肉桂酸-4-羟基化酶(C4H)、肉桂醇脱氢酶(CAD)、过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)。(2)对花茎挺直、弯曲两组芍药品种进行观测,发现花茎挺直芍药品种的花茎强度较高,而花茎弯曲芍药品种的花茎强度较低;与花茎弯曲芍药品种相比,花茎挺直芍药品种的花茎中硅和木质素含量均显著较高。(3)构建了盛花期芍药硅处理和对照花茎的cDNA文库用于转录组测序,样品的生物学重复性较好,平均每个文库的raw reads为77.59 M,过滤后的clean reads为67.86 M,过滤后的 clean bases 为 10.18 Gb,过滤后的 clean reads 中 Q20 为 98.52%、Q30为95.56%,过滤后的clean reads比例为87.48%,参考基因库的过滤后reads比例为85.47%,转录组已结果上传至NCBI SRA数据库(SRA:SRP329255)。(4)基因的差异表达分析共筛选到27594个差异表达基因(DEGs),硅处理诱导了 19228个DEGs上调、8365个DEGs下调。通过采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术对随机选择的12个DEGs表达水平进行检测,验证了转录组测序结果的准确、可靠。在与芍药花茎强度紧密相关的木质素生物合成途径上,硅处理诱导了 32个DEGs显著上调,包括了 4个PAL、3个C4H、5个4-香豆酰辅酶A连接酶基因(4CL)、3个莽草酸/奎宁酸对羟基桂皮酰基转移酶基因(HCT)、2个咖啡酰辅酶A O-甲基转移酶基因(CCoAOMT)、4个肉桂酰辅酶A还原酶基因(CCR)、3个(CAD)、2个阿魏酸5-羟化酶基因(F5H)、2个咖啡酸O-甲基转移酶基因(COMT)和 4 个POD,并且qRT-PCR检测显示HCT基因(i1HQPLc16595f8p01673)表达水平的差异倍数最大。(5)对候选基因HCT进行克隆,芍药PlHCT1基因核苷酸序列长1652 bp,开放阅读框为1371 bp,共编码 457个氨基酸,在Genbank中登录号为MK395539。芍药PlHCT1属于稳定、亲水性、非脂溶性蛋白,没有信号肽,未形成跨膜结构,主要二级结构为无规则卷曲(45.77%)、α-螺旋(34.99%)、延伸链(15.16%)和β-转角(4.708%),主要定位于细胞质中。硅处理诱导了PlHCT1基因在芍药花茎中的表达,并且它在花茎挺直芍药品种中的整体表达水平要高于花茎弯曲的芍药品种。(6)采用农杆菌介导的叶盘转化法将芍药PlHCT1基因转到烟草中,通过PCR和qRT-PCR鉴定了阳性转基因植株,超表达PlHCT1基因烟草植株的茎秆强度、木质素含量、加厚的次生细胞壁层数和木质素分布范围均显著高于野生型烟草。基于病毒诱导基因沉默(VIGS)技术将PlHCT1基因在芍药中沉默,通过PCR和qRT-PCR鉴定了阳性转基因植株,沉默PlHCT1基因芍药植株的花茎强度和木质素分布范围均显著低于对照和空载。
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