【背景与目的】男性不育的发病率越来越高，据统计已达到所有育龄夫妇的15％，其中40%-60%是由于男性精子发生异常或障碍，目前人工授精的方式不能满足所有患者的需要，如何才能让患者获得遗传学上属于自己的后代成为目前研究的热点。人脐带间充质干细胞(human umbilical cord Wharton’s jelly-derived mesenchymal stem cells,HuMSCs)来源于胚外中胚层，是一种能够向多个方向分化的成体干细胞,且具有取材方便、低免疫原性等优点，我们的前期研究表明，人脐带间充质干细胞（HuMSCs）在新生小鼠睾丸细胞培养液、维甲酸及睾酮的诱导培养下，诱导第7天形态上开始变细变长，形成类似“蝌蚪样”细胞，第3、7天表达生殖细胞标记OCT4、Ckit、CD49f、Stella，第14天表达生殖细胞特异标记DDX4；将 HuMSCs移植至不育小鼠睾丸曲细精管内，1个月后能够表达生殖细胞标记Stella、Dazl，移植后不发生排斥反应，且可发生迁移并能存活至少120天。但是诱导得到的细胞无法进一步诱导分化成为有功能的成熟的男性生殖细胞。目前国内外科学家也未能将成体干细胞成功诱导分化为有功能的生殖细胞，推测可能与成体干细胞分化潜能不足有关。2006年，日本京都大学Yamanaka研究小组首次将携带Oct4、Sox2、Klf4、c-myc的逆转录病毒导入小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblasts，MEF)，获得了在形态学、基因表达、表面抗原以及分化潜能等方面和胚胎干细胞十分相似的多能干细胞诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)。此后，多个实验室分别重编程出人和其他物种的诱导性多能干细胞，且通过使用小分子物质、蛋白质以及microRNA或者通过基因敲剪等方法提高了重编程效率，2008年，Liao等人利用OCT4、SOX2、KLF4、c-Myc、LIN28、NANOG六因子，成功将人皮肤成纤维细胞重编程为iPS细胞，且重编程效率达到1.6%左右，2010年，Cai等人利用逆转录病毒携带的OCT4、SOX2、KLF4、c-Myc四因子将HuMSCs成功重编程为iPS细胞，但是效率较低下，仅0.4%细胞被重编程。IPS细胞的出现，不仅摆脱了胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESCs)面临的伦理与免疫排斥问题，而且具有向三胚层分化的潜能，理论上可以向生殖细胞方向分化。目前，生殖细胞的诱导仍是一个世界性难题,仅小鼠ES细胞能够诱导出可育配子，人类ES细胞及iPS细胞体外经药物诱导诱导或DAZL基因家族过表达能够较低效率地产生早期原始生殖细胞和减数分裂后的单倍体细胞，利用小鼠精原干细胞条件培养基加上各种诱导剂也能够让 ES细胞突破减数分裂，但是这些方法均无法形成有功能的人类生殖细胞，诱导效率都非常低下，而且ES细胞面临取材和伦理及免疫排斥等诸多问题，影响了其临床应用。除人脐带间充质干细胞外，骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)也能在体外诱导也获得了早期生殖细胞，但是不能突破减数分裂，诱导获得的生殖细胞仅能检测了生殖细胞早期基因，如：DDX4、DPPA3、CD49f、DAZL等，不能检测到生殖细胞减数分裂期以及减数分裂后期的基因表达,如SYCP3、PRM1等。而iPS细胞能够经过诱导往男性生殖细胞方向分化，表达晚期生殖细胞标记，如SYCP3、PRM1等，并且能够突破减数分裂形成单倍体细胞。说明iPS细胞具有和ES细胞相似的分化潜能，而且避免了ES细胞面临的法律与伦理问题。因此，iPS细胞是目前最理想的自体细胞治疗的种子细胞，本实验结合 HuMSCs及iPS细胞的优点，利用慢病毒载体将OCT4、SOX2、KLF4、c-Myc、NANOG和LIN28六个转录因子导入 HuMSCs，将 HuMSCs重编程为 iPS细胞，再用 Bone morphogenetic protein4(BMP4)将iPS细胞向男性生殖细胞方向诱导分化。　　【材料与方法】采用贴壁法分离、培养、扩增出人脐带间充质干细胞；利用携带OCT4、SOX2、KLF4、c-Myc、LIN28和NANOG六因子质粒共转染293FT细胞，用293FT细胞包装携带上述六因子的慢病毒；再用慢病毒感染HuMSCs，将HuMSCs重编程为iPS细胞,挑取形态良好的克隆进行传代建系,并通过形态学观察、核型分析、碱性磷酸酶染色、多能基因 RT-PCR、ES特异性蛋白免疫荧光、体外拟胚体（embryoid body，EB）形成和体内畸胎瘤形成实验对iPS细胞的鉴定。鉴定完成后，挑选完全重编程的iPS细胞，在体外经EB（embryoid body）形成的方法，将其中一株iPS细胞（HuMSC- iPS1）向男性生殖细胞方向诱导分化。EB形成后第一天（D0），向实验组EB培养基中加入BMP4（100ng/ml），对照组（自发分化组）继续用 EB培养基培养，使其自发分化。分别于不同时间点（D0、D3、D7和D10）显微镜观察BMP4诱导组和自发分化组EB的形态学差异；RT-qPCR检测生殖细胞相关标记（DDX4、SYCP3和PRM1）表达量变化(以诱导前即D0的表达量为基础表达量，不同时间点的表达量均与基础表达量相比)；细胞免疫荧光检测生殖细胞早期标记 DDX4和减数分裂相关标记SYCP3。　　【结果】OCT4、SOX2、KLF4、c-Myc、LIN28和NANOG六因子感染后第十天就有形态各异的细胞团出现，感染后第十四天挑取细胞团传代建系。经形态学观察、多能基因RT-PCR、细胞核型分析、碱性磷酸酶染色、ES特异性蛋白免疫荧光、体内畸胎瘤形成和体外拟胚体形成等实验鉴定我们获得的iPS细胞具有与ES细胞类似的特性；重编程效率约为1.25%。获得的iPS细胞能够在 BMP4（100ng/ml）诱导下向男性生殖细胞方向分化，生殖细胞标记DDX4和SYCP3在诱导第七天表达量最高，分别达到基础表达量的4倍和5倍以上，而生殖细胞晚期标记PRM1的表达量在诱导第十天（D10）达到最高，达到基础表达量的3倍以上。免疫荧光检测结果表明：在诱导第七天（D7），BMP4诱导组和自发分化组均有DDX4表达，其中，BMP4诱导组表达明显比自发分化组强；SYCP3在 BMP4诱导组有少量表达，而自发分化组无表达。　　【结论】慢病毒携带OCT4、SOX2、KLF4、c-Myc、LIN28和NANOG六因子感染能够将HuMSC较高效率和快速地重编程为诱导性多能干（iPS）细胞，获得的iPS细胞可以在体外经BMP4（100ng/ml）诱导往生殖细胞方向分化。