绵羊瘤胃特异长链非编码RNA的鉴定与功能分析

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瘤胃是反刍动物独特的消化器官,其角质化鳞状上皮等结构为消化吸收和微生物发酵提供了环境基础。近年来研究表明,瘤胃发育可能起源于食道,在进化中从其他器官募集表达基因,强化了角质化、酮体代谢、免疫等功能。瘤胃这些功能的相关基因部分已知,但是其表达调控机制,尤其是长链非编码RNA(long noncodingRNA,lncRNA)水平的调控有待研究。lncRNA对基因表达有重要的调控作用,从lncRNA的角度探究家畜重要经济性状形成的遗传机制对育种工作具有重要的理论意义。本研究以反刍家畜——绵羊(Ovis aries)为研究对象,利用绵羊50种组织,共832个样本的转录组测序数据进行lncRNA的预测和分析。然后筛选在瘤胃中特异高表达的lncRNA,即瘤胃特异长链非编码RNA,进行了功能预测与分析。再利用胚胎时期的食道和瘤胃转录组以及染色质可接近性高通量测序技术(ATAC-seq)比较研究瘤胃特异lncRNA在发育中的功能。主要取得结果如下:(1)利用多种预测方法,在绵羊多组织中共鉴定了10006条高可信度的lncRNA,其中,2045个lncRNA已在绵羊4.0版本参考基因组中有注释,7961个lncRNA为新发现的lncRNA。与mRNA相比,lncRNA序列较短,外显子数目少,表达量低。对不同组织lncRNA进行聚类分析,结果基本符合发育和组织分化规律。通过对组织特异性lncRNA相关性分析,发现和瘤胃lncRNA最近的依次是网胃,食道,瓣胃,与角质相关性也比较高。(2)通过组织特异表达分析,筛选到343个瘤胃特异lncRNA。对瘤胃特异lncRNA和瘤胃表达的全部mRNA进行共表达网络分析显示,瘤胃特异lncRNA主要聚集在三个表达模块,其中一个模块包含42个lncRNA和492个编码基因,编码基因GO分析显示其显著富集在上皮细胞发育,上皮细胞分化,角质细胞分化等生物学过程(P<0.05)。该模块中包含6个核心lncRNA,其表达和IVL,Cart14等上皮细胞分化相关编码基因相关。此外,筛选到瘤胃特异lncRNA的邻近基因410个,GO富集结果显示与上皮细胞的迁移功能相关。(3)30个瘤胃特异lncRNA在胚胎时期瘤胃相对于食道表达显著上调,其中有11个属于共表达网络的瘤胃上皮细胞分化模块,说明这些参与瘤胃上皮分化过程的lncRNA在胚胎时期已经开始发挥作用。新发现的lncRNA MSTRG.39536.2是胚胎期瘤胃与食道差异显著的lncRNA,分布在瘤胃上皮细胞分化模块,并且其邻近基因是瘤胃上皮关键的转录因子,在瘤胃上皮细胞中高表达。(4)利用胚胎瘤胃和食道ATAC-seq研究瘤胃染色质开放区域,筛选出瘤胃特异lncRNA的顺式作用元件。结果表明8个瘤胃特异lncRNA位于瘤胃特异性开放可接近峰。其中,LOC105611675是一个已报道的lncRNA,其转录起始位点位于瘤胃特异性开放可接近峰上,在瘤胃中高表达,同时其邻近基因GJB2也与瘤胃上皮细胞分化相关。综上所述,本研究充实了绵羊多组织长链非编码数据库,筛选出了一系列可能调控瘤胃功能的特异表达lncRNA。并证明绵羊瘤胃特异lncRNA集中参与调控了瘤胃上皮细胞分化过程,且该调控在胚胎时期就可能已经产生,为反刍家畜瘤胃发酵的功能研究奠定了理论基础。
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