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目的:卵泡颗粒细胞所提供的营养和信号是决定卵子能否正常生长和成熟的关键。人类卵泡颗粒细胞上存在着线粒体解耦联蛋白2(UCP2)的表达。但UCP2在颗粒细胞中的具体作用尚末被充分阐释。UCP2在颗粒细胞生长、增殖过程中到底发挥了何种作用?是否参与了卵母细胞生存环境的调节?本研究以原代培养的人类卵巢颗粒细胞为研究对象,通过引入UCP2特异性抑制剂京尼平,分析UCP2抑制对颗粒细胞氧化水平和抗氧化能力、线粒体膜电位强度、及培养液中甾体激素水平的影响,探讨UCP2在颗粒细胞中的作用,以及对和卵母细胞成熟、卵子发育的可能影响,从而为改善当前辅助生殖技术周期妊娠结局提供新思路。
方法:以2011年10月~2012年10月在本生殖中心行常规IVF或ICSI的输卵管因素不孕者卵丘卵母的颗粒细胞进行原代培养,加入UCP2蛋白抑制剂京尼平,用实时荧光定量PCR(FQ-PCR)和Western blot检测和验证颗粒细胞UCP2mRNA和UCP2蛋白水平,并通过分析颗粒细胞的ROS水平、谷胱甘肽水平,线粒体膜电位水平,超氧化物歧化酶水平,以及培养液中E2、P激素水平的变化,以分析UCP2功能抑制对颗粒细胞的影响。
结果:
1、随着京尼平浓度增加,颗粒细胞活力呈下降趋势,在100μM时明显低于对照组。
2、京尼平呈浓度依赖性抑制UCP2蛋白表达,在20μM和50μM时明显低于对照组;京尼平浓度20μM时,随着作用时间的延长,蛋白水平表达呈下降趋势,在24h和48h明显低于对照组;而mRNA水平并未随着京尼平浓度的改变而发生明显改变。
3、颗粒细胞过氧化损伤随京尼平浓度增加而增加,表现为细胞ROS水平呈上升趋势,在50μM时明显高于对照组;总谷胱甘肽和GSH含量呈下降趋势但无显著性差异,而GSH/GSSG比值呈下降趋势并在50μM时明显低于对照组;MnSOD活力呈增高趋势,在50μM时明显高于对照组。
4、随着京尼平浓度增加,UCP2蛋白表达下降,线粒体膜电位呈降低趋势,在20μM和50μM时明显低于对照组。
5、随着京尼平浓度增加,颗粒细胞甾体激素雌二醇、孕酮分泌呈下降趋势,孕酮水平在50μM时明显低于对照组。
结论:
1、颗粒细胞UCP2表达和ROS生成呈负相关,即UCP2控制颗粒细胞过氧化水平,保护细胞抵抗氧化损伤,抗氧化反应增强。
2、颗粒细胞UCP2表达影响线粒体相关功能,UCP2低表达时线粒体膜电位降低,UCP2的过低表达时预示细胞趋向早期凋亡。
3、UCP2有助于颗粒细胞分泌功能,从而有利于卵母细胞的成熟、卵泡的发育,可以为当前辅助生殖技术周期妊娠结局提供新思路。