丁二酸又称琥珀酸，是三羧酸循环的中间产物，广泛存在于人体、动物、植物和微生物中，其作为优秀的C4平台化合物，可被应用于合成1，4-丁二醇，四氢呋喃，γ-丁内酯等有机化学品以及聚丁二酸丁二醇酯(PBS)类生物可降解材料，被美国能源部认为是未来12种最有价值的生物炼制产品之一。发酵法生产丁二酸具有利用可再生资源，固定温室气体CO2等优点越来越引起人们的兴趣。大肠杆菌由于具有培养条件简单，代谢网络较明确，易改造，易操作等特点，近年来成为生物法合成丁二酸的研究热点。本研究运用统计学方法对两阶段发酵的基本培养条件进行优化，并考察好氧阶段添加葡萄糖或乙酸钠、厌氧阶段添加不同还原性碳源对发酵过程的影响，研究重组大肠杆菌两阶段发酵合成丁二酸过程的关键因素，以提高丁二酸的产量。　　 本论文以过量表达苹果酸酶的Escherichia coli NZN111为出发菌株，首先对影响丁二酸发酵的诱导剂IPTG浓度、CO2供体、葡萄糖浓度进行考察。采用Plackett-Burman设计法筛选出影响丁二酸产量的五个主要影响因子：乙酸钠、碳酸镁、接种量、诱导剂IPTG加入时间和发酵周期。在此基础上采用响应曲面法对这五个因子的影响进行研究，得出多元二次回归方程，在最优化的条件下葡萄糖浓度为22 g/L时，乙酸钠1 g/L，碳酸镁17 g/L，接种量10％，IPTG起始加入，发酵周期76 h，丁二酸产量达到15.64 g/L，质量收率为71.1％，相比初始发酵条件下提高了17.3％。通过利用天然培养基和合成培养基进行发酵对比，结果表明合成培养基可以替代价格较昂贵的天然培养基厌氧发酵生产丁二酸。　　 考察在好氧培养基中分别添加不同浓度葡萄糖或乙酸钠对两阶段发酵菌体生长、酶活及代谢产物分布的影响。其中添加4 mM葡萄糖和12 mM、54 mM、80 mM乙酸钠均可以提高好氧阶段的菌体密度和相关酶活，将不同条件下培养的菌体转接厌氧发酵后，厌氧阶段的酶活和代谢产物分布也发生改变，目标产物丁二酸的产量都有所提高。结合代谢途径分析可知，在厌氧发酵过程中磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶(PCK)是产丁二酸的关键酶，丙酮酸激酶(PYK)主要和副产物丙酮酸的积累有关，异柠檬酸裂解酶(ICL)对丁二酸产量也有一定影响。在好氧培养基中添加80 mM乙酸钠，厌氧发酵结束时PCK酶活提高，PYK酶活降低，丙酮酸的积累减少，丁二酸的收率为最高，达到89.0％，相比对照未添加的提高了16.6％。　　 在厌氧培养基中添加不同还原性碳源，考察发酵过程中氧化还原电位、辅酶NADH、菌体生长以及代谢产物的变化规律。分别以甘露醇、葡萄糖和葡萄糖酸钠作为碳源，结果表明随着发酵时间的延长，胞外氧化还原电位值下降，胞内NADH浓度下降，且还原性越强的碳源胞内NADH浓度越高。发酵结束时，还原性最高的甘露醇对丁二酸的质量收率最高，葡萄糖次之，葡萄糖酸钠最低，分别为99.7％，83.0％和40.5％。