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空心莲子草(Alternanthera philoxeroides)是我国第一批公布的外来入侵杂草之一,因其极强的适应能力和繁殖能力,会严重破坏入侵地的生物多样性和生态系统,给农业生产和经济社会发展带来严重威胁。莲子草假隔链格孢(Nimbya alternantherae)是具有潜在开发价值的空心莲子草生防真菌。前人已对其除草效果、其代谢产物的除草活性及作用机理等进行过较多研究,但迄今尚未见有关该菌效应蛋白致病功能方面的研究报道。本研究通过生物信息学分析预测莲子草假隔链格孢全基因组中的效应蛋白(effector),然后采用毕赤酵母真核表达系统对预测获得的部分效应蛋白进行表达,并测定表达产物的致病作用。具体结果如下:1.效应蛋白预测分析。通过Signal P、TMHMM、Target P和Pro Comp等程序对莲子草假隔链格孢全基因组的10470个蛋白序列进行分析预测,得到889个分泌蛋白;结合小分子(<300 aa)和富含半胱氨酸(≥6)的序列特征,从889个分泌蛋白中筛选获得110个候选效应蛋白;进一步结合宏转录组表达数据,获得48个效应蛋白。通过与PHI和Nr数据库比对以及GO、KOG和KEGG分析,对48个效应蛋白进行了功能分类和注释。2.七个效应蛋白的基因克隆和真核表达。根据48个效应蛋白的分析表达量和结构与功能特点,选取其中的g121、g925、g4757、g5745、g7484、g7868和g9900共7个进行基因克隆和真核表达。分别获得7个效应蛋白的基因组序列和开放阅读框序列,进一步分析内含子数目以及进化关系,并同近缘物种间进行同源基因比较。将获得的7个基因片段同真核表达载体p PICZαA连接构建重组表达载体,通过电穿孔系统将其导入毕赤酵母GS115中,利用甲醇诱导效应蛋白表达,SDS-PAGE检测表达产物。结果7个效应蛋白均检测到预测蛋白分子量的目的条带,说明全部表达成功。3.效应蛋白致病性测定。选取生长一致、健康无病的空心莲子草叶片和植株,分别通过离体叶片压伤斑接种法和植株根部接种法测定效应蛋白表达产物对空心莲子草的致病作用,以接种空载体表达产物、BMMY培养基、无菌水为对照。离体叶片处理72 h后,表达产物处理的伤斑处变为黑褐色,病斑扩散明显,叶片大部分或整个叶片水渍状变褐,而空载体表达产物和BMMY培养基处理的仅伤斑处稍变黑,病斑无明显扩散,无菌水处理的仅伤斑处稍变黄。根部处理的除g4757作用较慢外,其他6个效应蛋白表达产物处理植株均于处理后12 h出现明显萎蔫症状,而且症状随着处理时间的延长不断加重,而空载体表达产物、BMMY培养基、无菌水对照的植株正常生长。结果表明,7个效应蛋白的表达产物均对空心莲子草具有致病作用。