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一、研究背景和目的2011年5月,肠出血型大肠埃希菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli,EHEC)0104:H4的感染在德国暴发,并迅速蔓延至欧洲、美国等16个国家。全球共报告了 4137例病例,50例死亡。EHEC 0104:H4聚合了肠聚集型大肠杆菌、肠出血型大肠埃希菌和肠致病型大肠杆菌的致病特性,致病性极强。EHEC 0104:H4含有以下毒力基因:志贺毒素Ⅱ基因(stx2)、EAEC的质粒因子主调控基因(aggR)、运输蛋白基因(aatA)、菌毛操纵子基因(aggC)、菌毛亚单位基因(aggA),不含有:紧密黏附素基因(eaeA)、肠溶血素基因(hly)。感染EHEC 0104:H4可引起出血性腹泻、出血性结肠炎、溶血性尿毒综合征和血栓性血小板减少性紫癜。转运蛋白基因aatA存在于pAA毒力质粒上,编码外膜蛋白自分泌黏附素,是EHEC O104:H4的主要致病基因,是aat-PABCE转运系统的一部分,对致病蛋白的运输有重要作用。转运蛋白AatA可促进大肠埃希菌0104:H4对宿主细胞的黏附、侵袭,破坏其自我保护屏障。该蛋白有三个保守性区域:N-端结构域发起转运进入内膜,α-结构域功能多样,C-端β折叠结构域形成β桶镶嵌到外膜上,将致病蛋白转运到细菌外膜。stx2是EHEC O104:H4的主要致病基因,A1片段是其毒力活性中心。本研究试图人工合成肠出血型大肠埃希菌O104:H4的转运蛋白基因aatA和志贺毒素Ⅱ的A1片段stx2A1,进行原核表达并制备克隆抗体。以抗GST-AatA单克隆抗体和抗GST-Stx2A1单克隆抗体分别研制免疫胶体金检测试纸条,测定该试纸条的灵敏度、特异性和重复性,验证试纸条的性能。成功制备出GST-AatA和GST-Stx2A1双靶标试纸条,能够检测肠出血型大肠埃希菌O104:H4的模拟菌株,使肠出血型大肠埃希菌O104:H4能够实现现场检测。二、研究方法1.EHEC O104:H4 aatA和stx2A1基因片段的合成、表达、纯化人工合成转运蛋白aatA和stx2A1的基因序列,分别连接至pMD18-T载体,转化E.coli DH5a,切胶回收,连接到PGEX-6P-1,转化到工程菌E.coli BL21(DE3)中。IPTG诱导表达融合蛋白 GST-AatA和GST-Stx2A1,SDS-PAGE和 Western Blot分析融合蛋白的表达并纯化该重组蛋白。2.EHEC O104:H4 GST-AatA蛋白和GST-Stx2A1蛋白的单克隆抗体的制备选取7周龄、雌性Balb/c小鼠。首次免疫以50 μg GST-AatA蛋白为抗原,与弗氏完全佐剂完全乳化,小鼠背部皮下多点注射。每隔2周加强免疫,共进行2次。1周后采血,测血清效价。效价大于1:10000即可进行细胞融合。利用有限稀释法和间接ELISA法筛选阳性孔,体内诱生法大量制备收集小鼠腹水,饱和硫酸铵法进行粗提,亲和层析进一步纯化,间接ELISA法检测腹水效价。3.免疫胶体金检测技术的建立以抗GST-AatA单克隆抗体研制免疫胶体金检测试纸条;以抗GST-Stx2A1单克隆抗体研制免疫胶体金检测试纸条;成功制备出检测肠出血型大肠埃希菌O104:H4的免疫胶体金试纸条,并测定上述三种试纸条的特异性、灵敏度、及重复性,验证试纸条的性能。三、结果1.EHEC O104:H4 GST-AatA 蛋白和 GST-Stx2A1 蛋白的表达以EHEC O104:H4合成的转运蛋白基因aatA和志贺毒素Ⅱ的A1片段stx2A1为模板,经过PCR扩增后的目的片段长度分别为510 bp和720 bp。以挑取的重组菌E.coli BL21的单菌落为模板进行PCR扩增,电泳后可见510 bp和720 bp左右的阳性条带。诱导后的细菌有新蛋白条带产生,GST-AatA和GST-Stx2A1表达蛋白的Mr约为46000和55000,均与预期相符。2.EHEC O104:H4 GST-AatA蛋白和GST-Stx2A1蛋白的单克隆抗体的制备将纯化后的融合蛋白GST-AatA和GST-Stx2A1免疫Balb/c小鼠,制备出单克隆抗体。本采用饱和硫酸铵法初步纯化,亲和层析法进一步纯化,经过SDS-PAGE电泳鉴定,纯度可达95%和96%。3.免疫胶体金检测技术的建立制备出GST-AatA融合蛋白、GST-Stx2A1融合蛋白和肠出血型大肠埃希菌O104:H4的免疫胶体金检测试纸条。四、结论以EHEC O104:H4合成的aatA和stx2A1基因片段为模板,PCR扩增出这两个基因。分别挑取重组菌E.coli BL21的单菌落,进行PCR扩增,通过对aatA和stx2A1基因克隆进行筛选,电泳后可见510 bp和720 bp的阳性条带,切胶回收后的目的片段进行测序,证实该扩增产物为目的片段。通过对表达条件的优化,确定最适诱导aatA和stx2A1基因表达融合蛋白GST-AatA和GST-Stx2A1的IPTG终浓度均为0.1 mmol/L。诱导后有新的蛋白产生,相对分子量约为46000和55000,与预期相符。用纯化后的融合蛋白GST-AatA和GST-Stx2Al分别免疫Balb/c小鼠,制备出单克隆抗体。经鉴定两种抗体均为IgG1亚类;GST-AatA和GST-Stx2A1单克隆抗体的纯度依次为97%和96.8%;成功制备出检测肠出血型大肠埃希菌O104:H4的免疫胶体金检测试纸条。