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研究背景:支气管哮喘(asthma)是最常见的气道慢性炎症性疾病,其发病率在发达国家可达人群33%,且有持续上升的趋势。哮喘的本质是气道慢性炎症,经典免疫学说认为Th1/Th2细胞功能失衡后Th2优势介导的嗜酸性粒细胞性炎症与哮喘的发病密切相关。近年发现Tregs/Th17细胞平衡是的一个重要免疫平衡,它们在分化发育和功能上相互抑制,已有研究证实该平衡在哮喘的发病机制中起到关键作用,表现为Th17细胞功能过强,使抗原被不断递呈而加重气道高反应;而Tregs功能减弱,不能有效抑制Th17引起的过度亢进的气道反应,最终加重了哮喘。IL-35作为IL-12家族新的一员,主要表现为促进Tregs细胞的增殖和分化,抑制Thl7细胞的分化及促炎症细胞因子IL-17的表达,所以我们推测IL-35将成为哮喘研究的新热点,并将成为哮喘防治的新靶点。卡介苗(BCG)是包括中国在内的发展中国家在新生儿期广泛接种的减毒活疫苗。动物实验证实BCG及其有效成分可通过诱导IFN-γ的产生,抑制呼吸道嗜酸性粒细胞反应;近来研究还发现,灭活分枝杆菌疫苗还可通过诱导过敏原特异性Tregs,减少肺内IL-17含量,达到预防和治疗哮喘目的。本实验拟通过比较新生期卡介苗(BCG)与重组IL-35+BCG接种后对哮喘动物模型Tregs、Th17发育及Tregs/Th17平衡的影响,观察BCG抗哮喘作用的是否与Tregs/Th17失衡有关,明确重组IL-35+BCG新生期接种能否有抗哮喘的作用,进一步阐明T细胞亚群尤其是Tregs/Th17平衡在哮喘发病中的作用。我们通过动物模型对以上假设分为两部分进行了初步探讨:第一部分BCG对实验性哮喘小鼠模型Tregs/Th17功能平衡影响目的:建立BCG新生期接种的小鼠致敏模型和哮喘模型,探讨BCG在哮喘气道炎症不同阶段干预实验性哮喘模型是否是通过调节Tregs/Th17平衡,并通过干预模型了解哮喘发生发展不同阶段的发病机制。方法:1)新生清洁级BALB/c小鼠分为3组:对照组、OVA组、BCG+OVA组,新生期接种后分别在4周和6周除对照组外均进行OVA致敏,小鼠致敏期模型在进行激发前即7周进行相关检测;小鼠哮喘模型在第7周开始使用OVA激发,连续激发一周,最后一次激发后24小时内,进行相关检测;2)取小鼠脾脏单个核细胞用流式细胞仪检测辅助性T细胞亚群Th17细胞、Tregs细胞比例;3)进行支气管肺泡灌洗,瑞氏-姬姆萨染色检测BALF中白细胞总数及分类计数,ELISA检测血清中OVA特异性Ig E水平;4)肺组织HE染色进行肺组织炎症分析。结果:1)在致敏期:对照组、OVA组、BCG+OVA组三组小鼠肺部均无明显炎症,肺泡间隔无增厚,血管周围和支气管细支气管周围无明显炎症细胞浸润;与对照组比较,各致敏组小鼠BALF中细胞总数、淋巴细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞均明显增加,和OVA组相比:新生期接种BCG气道高反应性显著降低,BALF中细胞总数、淋巴细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞均明显降低;流式结果提示和对照组比较:BCG+OVA组Tregs细胞比例较对照组上升。2)在激发期:各致敏组小鼠肺泡灌洗液中大量中性粒细胞和嗜酸性粒细胞浸润,新生期接种BCG组和OVA组比较:肺泡灌洗液中炎症细胞总数、淋巴细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞比例,肺部病理炎症和气道高反应性均显著降低;流式结果提示TH17细胞比例明显低于OVA组,而Tregs细胞与OVA组比较没有差异。结论:1)在实验性哮喘模型的致敏期肺组织局部没有明显的炎症反应,但有炎症细胞动员增加和血清OVA特异性Ig E水平显著增高;2)小鼠新生期接种BCG能显著降低致敏期气道炎症细胞浸润,但对血清OVA特异性Ig E水平无显著抑制作用,在激发期,气道急性炎症主要由TH17介导;3)在致敏期,虽然BCG+OVA组和OVA组TH17、Tregs均比对照组高,但两组间并无明显区别。而在哮喘期BCG+OVA组比OVA组TH17显著降低,说明新生期接种BCG,可于致敏后激发时,显著降低TH17细胞浸润,提示BCG减轻气道炎症与抑制TH17分化相关。第二部分IL-35+r BCG新生期接种对实验性哮喘模型Tregs/Th17平衡的影响目的:建立r BCG新生期接种的小鼠致敏模型和哮喘模型,观察生命早期进一步加强Tregs类免疫反应后,致敏和哮喘发作阶段气道炎症受到的干预作用及其机制。方法:1)新生清洁级BALB/c小鼠分为3组:对照组、OVA组、r BCG+OVA组,新生期接种后分别在4周和6周除对照组外均进行OVA致敏,小鼠致敏期模型在进行激发前即7周进行相关检测;小鼠哮喘模型在第7周开始使用OVA激发,连续激发一周,最后一次激发后24小时内,进行相关检测。2)取小鼠脾脏单个核细胞用流式细胞仪检测辅助性T细胞亚群Th17细胞、Tregs细胞比例;3)进行支气管肺泡灌洗,瑞氏-姬姆萨染色检测BALF中白细胞总数及分类计数,ELISA检测血清中OVA特异性Ig E水平;4)肺组织HE染色进行肺组织炎症分析。结果:1)在致敏期,与OVA组比较:小鼠新生期接种r BCG能显著减少肺泡灌洗液中炎症细胞动员,但降低OVA特异性Ig E不显著;而在流式结果中提示TH17细胞及Tregs细胞比例均没有明显差异。2)在激发期,与OVA组比较:新生期接种r BCG显著降低肺部炎症病理状况,减少中性粒细胞和嗜酸性粒细胞聚集,降低血清OVA特异性Ig E;且r BCG+OVA组TH17细胞比例明显低于OVA组,而Tregs细胞比例明显高于OVA组。结论:1)小鼠新生期接种r BCG加强生命早期机体Tregs介导免疫反应,能显著降低小鼠致敏模型和哮喘模型的气道炎症和血清OVA特异性Ig E水平;2)在哮喘期r BCG+OVA组Tregs明显高于OVA和对照组,TH17细胞比例明显低于其余两组,进一步说明r BCG新生期接种在生命早期加强Tregs介导的免疫应答,有利于在发生哮喘时诱导Tregs细胞发挥抗哮喘作用。