神经组织工程为神经系统类疾病的治疗提供了可行的方法，其实质就是将多种有利于神经再生的微环境要素进行有效整合，从而实现神经修复与再生。种子细胞、支架材料和生长信息是构成组织工程的三大关键要素。神经干细胞(neural stem cells，NSCs)作为一类具有自我更新及多向分化潜能的细胞，被认为是神经组织工程理想的种子细胞。近年来研究发现，导电聚合物(conducting polymers，CPs)作为一种新型“智能”材料，其可用作导电支架单独或协同电刺激(electrical stimulation，ES)对NSCs的行为进行定向调控。然而目前基于导电聚合物的组织工程支架材料发展仍不成熟，如制备方法低效、支架电导率低及结构单一等缺点，使其很难满足组织工程应用。鉴于聚3，4-乙撑二氧噻吩(poly(3，4-ethylenedioxythiophene)，PEDOT)优异的光电特性和环境稳定性，本研究发展了基于PEDOT的新型三维导电支架材料，旨在通过导电支架及电刺激联合调控NSCs的体外增殖及定向分化，从而为神经修复与再生提供可能的途径。　　本文首先成功分离培养了胎鼠海马区来源的NSCs。不同接种密度下细胞生长曲线显示，NSCs体外悬浮培养的最佳接种密度为1×105-2×105cells/mL，同时适宜的传代时间为5-7天。通过蛋白及基因分析，鉴定所培养的NSCs具有自我更新及多向分化潜能。NSCs表达其特异性标志物(Nestin+/Sox2+/CD133+/CD34-/CD45)，同时可被血清分化培养基诱导分化为神经元(βtubulin-Ⅲ+)，星形胶质细胞(GFAP+)和少突胶质细胞(O4+)。因此，分离培养的细胞具备NSCs生物学特性，可用于后续实验研究。　　由于PEDOT具有优异的光电特性、环境稳定性及良好的生物相容性，而被发展用于构建神经组织工程导电支架。本文分别采用化学交联法和界面聚合法制备了PEDOT-透明质酸/壳聚糖/明胶(PEDOT-HA/Cs/Gel)和PEDOT/壳聚糖/明胶(PEDOT/Cs/Gel)三维导电支架，并对其物理化学特性及生物相容性进行了评价。实验选取透明质酸（hyaluronic acid，HA）为掺杂剂，采用化学聚合法制得直径约为200-300nm的PEDOT-HA导电纳米颗粒。然后通过化学交联法将PEDOT-HA成功引入壳聚糖和明胶大分子中，得到不同质量百分比的PEDOT-HA/Cs/Gel导电支架。此外，实验利用壳聚糖和明胶大分子的吸水性，以及单体3，4-乙撑二氧噻吩(3，4-ethylenedioxythiophene，EDOT)溶于有机相的特点，采用界面聚合法(interfacial polymerization)在Cs/Gel支架的孔壁表面原位聚合了一层颗粒直径约为50nm的PEDOT导电纳米涂层，从而制得不同摩尔浓度比的PEDOT/Cs/Gel导电支架。两类导电支架的物理化学特性表明，导电聚合物PEDOT的引入降低了支架的吸水率和体外降解率，但是提高了支架的表面粗糙度、电导率和压缩模量。两种不同方法制备的支架相比较，PEDOT/Cs/Gel支架的电导率明显高于PEDOT-HA/Cs/Gel支架。生物相容性结果表明，PEDOT-HA/Cs/Gel和PEDOT/Cs/Gel导电支架均有利于PC12细胞的粘附。其中8％PEDOT-HA/Cs/Gel支架组可保持细胞良好的增殖活性，而2PEDOT/Cs/Gel支架组则显著提高了细胞的增殖能力。　　为了研究所制备的导电支架对NSCs行为的影响，实验分别选取8％PEDOT-HA/Cs/Gel和2PEDOT/Cs/Gel导电支架对NSCs进行体外三维培养，考察了两类导电支架材料对NSCs粘附、代谢、增殖及分化的影响。与Cs/Gel支架相比，PEDOT-HA/Cs/Gel和PEDOT/Cs/Gel导电支架显著提高了NSCs的粘附率。将NSCs增殖培养14天后，蛋白及基因分析结果表明，导电支架有利于NSCs的增殖，可上调Nestin、Sox2及Ki67相关蛋白及基因的表达。细胞代谢实验也表明，NSCs可在导电支架内维持较高的细胞增殖速率。将NSCs在增殖培养基中扩增培养4天后，用分化培养基继续诱导分化培养6天。细胞免疫荧光染色及RT-qPCR基因检测结果表明，PEDOT-HA/Cs/Gel和PEDOT/Cs/Gel导电支架促进了NSCs向神经元(βtubulin-Ⅲ+)及星形胶质细胞(GFAP+)的分化，上调了其相关蛋白及基因的表达。此外，研究发现PEDOT-HA/Cs/Gel与PEDOT/Cs/Gel支导电架在影响NSCs粘附、代谢、增殖及分化行为中并无显著性差异。　　本文还进一步考察了导电支架协同电刺激对NSCs增殖与分化的影响。实验采用不同电压强度(0mV、25mV、50mV、100mV和200mV)对导电支架内的NSCs进行电刺激(4h/day)。PEDOT-HA/Cs/Gel和PEDOT/Cs/Gel支架组分别在100mV和50mV电压条件下达到最高细胞活性值。蛋白及基因分析结果表明，电刺激不仅促进了导电支架内NSCs的增殖，而且有利于NSCs向神经元方向的分化。此外，实验还考察了在离子通道阻断剂的作用下，导电支架协同电刺激对NSCs分化的影响。研究发现电刺激显著提高了导电支架内NSCs向神经元方向的分化，同时增强了分化细胞内Ca2+荧光强度。因此实验结果初步表明，导电支架协同电刺激可能是通过调控细胞膜表面Ca2+、Na+、K+、Cl-电压门控离子通道来作用NSCs分化的，其中起主要作用的是Ca2+和Na+通道。　　综上所述，本文成功制备了新型PEDOT-HA/Cs/Gel和PEDOT/Cs/Gel三维导电支架，两类导电支架均具有良好的电活性及生物相容性，有利于NSCs的粘附和增殖，可促进NSCs向神经元及星形胶质细胞的分化。同时导电支架可协同电刺激进一步增强NSCs向神经元方向的分化。因此，PEDOT-HA/Cs/Gel和PEDOT/Cs/Gel三维导电支架有望用作神经组织工程支架材料，以联合电刺激实现NSCs的定向分化。