第一部分 Kpnβ1在非小细胞肺癌中的表达及临床意义目的:研究Kpnβ1在非小细胞肺癌中的表达及与预后的关系,探索Kpnβ1作为潜在靶点在非小细胞肺癌检测中应用的可能性。方法:收集154例组织标本,其中包括8例新鲜NSCLC患者的癌组织及癌旁组织和146例NSCLC蜡块组织及相对应癌旁组织。运用Western Blot方法检测新鲜NSCLC及癌旁组织中Kpnβ1及PCNA蛋白的表达。将146蜡块组织及相对应的癌旁组织进行免疫组化染色,检测石蜡组织切片中Kpnβ1蛋白的表达情况,并统计学分析Kpnβ1的表达与146例NSCLC患者临床病理参数之间的关系,分别使用COX多因素分析及Kaplan-Meier生存曲线分析Kpnβ1蛋白的表达与患者预后之间的关系。结果:(1)Kpnβ31蛋白在新鲜NSCLC组织中的表达较癌旁组织明显增高,差异有统计学意义(P<0.05);同时Western Blot结果还提示新鲜NSCLC中PCNA蛋白的表达较癌旁组织中也明显增高,与Kpnβ1蛋白表达趋势一致。(2)免疫组化结果显示:Kpnβ1及Ki-67蛋白主要表达于细胞核,阳性表达呈黄色或者棕黄色。Kpnβ1及Ki-67在NSCLC组织中的阳性表达均明显高于正常肺组织,且与NSCLC的分化程度有关,分化程度越低标本中Kpnβ1及Ki-67蛋白的表达较多。(3)统计学分析结果显示:Kpnβ1高表达与患者年龄(p=0.038<0.05)、临床分期(p<0.001)、组织分化程度(p=0.017<0.05)、肿瘤大小(p=0.028<0.05)、淋巴结是否转移(p<0.001),以及Ki-67的表达高低(p=0.013<0.05)相关,差异有统计学意义。而与患者的性别、组织学分型与吸烟状况无明显关系(P>0.05)。在多因素分析中,Kpnβ1 蛋白的高表达(HR,1.911,95%CI.1.015-3.598;P=0.045)和组织分化程度(HR,3.226,95%CI,2.026-5.136;P<0.001)是影响 NSCLC 预后的独立因素,Kaplan-Meier生存曲线提示Kpnβ1高表达组较Kpnβ1低表达组生存率差,差异有统计学意义(P<0.001)。结论:Kpnβ1蛋白在NSCLC组织中呈高表达,并与患者年龄、临床分期、组织分化程度、肿瘤大小、淋巴结转移、以及Ki-67的表达密切相关;Kpnβ1高表达较低表达的患者预后差,是影响NSCLC预后的独立因素。第二部分 Kpnβ1通过PI3K/AKT通路对非小细胞肺癌增殖能力的影响目的:通过运用分子生物学方法检测沉默Kpnβ1基因后肺癌细胞增殖能力和对顺铂敏感性的变化情况,及对PI3K/AKT信号通路相关蛋白表达的影响。探讨Kpnβ1通过PI3K/AKT信号通路影响NSCLC生物学特性的可能机制。方法:Western blot方法检测Kpnβ1蛋白在NSCLC细胞株(A549,H1299与SPCA-1)中的表达,Kpnβ1蛋白在A549细胞株表达最高,然后用流式细胞仪检测细胞的周期变化;同时,使用Western Blot方法检测Kpnβ1、PCNA和Cyclin D1蛋白在细胞不同周期时相的表达情况。用Kpnβ1的短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)敲低A549细胞内的Kpnβ1表达,随后用CCK-8、平板克隆形成试验与5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷试剂盒(5’ethynyl-2’-deoxyuridine,EdU)检测下调Kpnβ1基因后A549细胞增殖能力的改变;流式细胞仪检测下调Kpnβ1基因对A549细胞周期进程的影响。此外,本研究通过CCK-8方法检测了 Kpnβ1基因沉默后A549细胞对CDDP敏感性的改变。并通过Western Blot方法进一步验证Kpnβ1沉默及顺铂处理后Kpnβ1蛋白、PI3K,p-AKT(Ser473)和p-AKT(Thr308)蛋白的表达以及细胞凋亡指标cleaved-parp表达情况。结果:(1)Kpnβ1蛋白在A549、H1299及SPCA-1中均有表达,而在A549中的表达高于另外两株细胞系,因此,我们选取A549细胞用于后续实验。(2)对A549细胞进行流式细胞仪检测发现,A549细胞在血清饥饿培养时,细胞增殖能力明显受到抑制,细胞周期被阻滞在G0/G1期;恢复血清供应培养后,细胞增殖能力恢复,由G0/G1期进入S期,G0/G1期比例由72.32%下降至35.08%,S期细胞由22.55%增加至56.62%;同时,血清饥饿后,Kpnβ1表达水平明显降低,恢复血清供应培养后,Kpnβ1的表达随细胞增殖力升高也逐渐升高,在48h达到高峰;Kpnβ1的表达与Cyclin D1及PCNA的趋势一致;而干扰Kpnβ1基因后,Cyclin A2、Cyclin D1以及PCNA的表达较对照组则明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。(3)CCK8方法、平板克隆实验及EdU试剂盒检测均发现Kpnβ1表达下调后,与对照组相比,干扰组细胞增殖能力明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。(4)流式细胞检测发现Kpnβ1基因沉默后A549细胞G0/G1期细胞增加(从65.31%至77.77%),S期细胞减少(从25.99%至17.94%),差异有统计学意义(P<0.05)。(5)顺铂敏感性检测结果发现,经不同浓度顺铂处理后,Kpnβ1基因干扰组和对照组细胞增殖力均有下降,以Kpnβ1干扰组下降最明显,且与CDDP剂量呈正相关,在CDDP20 μmol/L浓度时最明显,差异有统计学意义(P<0.05)。(6)Kpnβ1沉默后 PI3K/AKT通路相关蛋白 PI3K,p-AKT(Ser473),p-AKT(Thr308)和PCNA的表达水平较对照组均明显降低。(7)为进一步探讨Kpnβ1基因与顺铂的协调作用,用Western Blot检测用Kpnβ1干扰与顺铂处理后,PI3K,p-AKT(Ser473)and p-AKT(Thr308)蛋白的表达变化,结果显示:Kpnβ1基因沉默组、顺铂处理组及Kpnβ1基因沉默联合顺铂处理组的PI3K,p-AKT(Ser473)和p-AKT(Thr308)蛋白表达与对照组相比均明显降低,其中以Kpnβ1-shRNA联合CDDP处理组各蛋白表达降低最明显。此外,与对照组相比其他三组细胞凋亡指标cleaved-parp表达均增高,以两者联合组cleaved-parp表达增高最明显。结论:沉默Kpnβ1基因能够抑制NSCLC细胞增殖,增加NSCLC细胞对CDDP的敏感性;Kpnβ1可能通过调控PI3K/AKT信号通路发挥其作用。本研究探讨了 Kpnβ1在非小细胞肺癌中的表达及其可能的作用机制,为进一步应用于临床提供实验室基础及理论依据。