背景:已有的研究表明,TGF-β超家族对成骨细胞和破骨细胞都有不同程度的调节作用。作为该家族成员之一,TGF-β1主要存在于骨组织中,对骨转换过程起到了重要的调控作用。ALK5是TGF-β1Ⅰ型受体TβR1中的亚型受体之一,能同时激活Smad2和Smad3蛋白,参与调控骨转换。本次实验目的在于观察TGF-β1及其受体信号通路与氟诱导的骨形成是否存在分子联系,揭示并阐明TGF-β1及其受体信号通路在氟中毒骨病变发生机制中的作用,为改善氟骨症和相关骨代谢病的防治提供理论依据和科学对策。方法及结果:实验采用建立疾病动物模型与体外细胞培养相结合的方式,探讨TGF-β1及其受体信号通路在氟骨症骨转换调控中的作用。以成年雄性Wistar大鼠为实验对象,采用灌胃给氟两个月的方式建立氟骨症动物模型。染氟一个月后,腹腔注射TGF-β1亚型受体ALK5抑制剂SB431542,持续给药一个月。染氟一月开始观察到大鼠牙齿出现白垩色。随着染氟浓度及时间的进一步增加,牙齿变脆易折,呈现典型的氟斑牙病变特征。用乙醚麻醉大鼠,眼球后静脉丛取血,分离大鼠股骨、胫骨。通过观察骨组织病理明确骨骼病变特点,确定氟骨症模型特征。我们观察大鼠一般体征,并使用常规和一些先进技术手段包括双能X线骨密度仪、常规病理、免疫组化、实时定量聚合酶链式反应(RT-PCR)以及酶联免疫吸附法等进行实验研究分析。通过双能X线骨密度仪分析的骨密度结果显示,高氟组(20mg F-/kg.day)大鼠骨密度与对照组相比降低。相应地,该组大鼠板层骨排列发生紊乱,免疫组化检测到骨钙素OCN蛋白的表达也受到抑制。基因水平分析发现高氟抑制了Runx2基因的表达,但是对RANKL基因的表达有促进作用。染氟还促进了血清中成骨、破骨相关因子PINP和CTX的表达。此外,氟刺激了Smad3基因的表达但抑制了P38MAPK基因的表达。这些结果表明投氟两个月明显促进了以骨吸收表现显著为特征的骨转换过程,并伴随着TGF-β1下游因子Smad3表达的升高及P38MAPK表达的下降。为了探明TGF-β1和氟诱导的骨转换之间的关系,我们加入SB431542抑制剂,观察成骨、破骨相关因子发生哪些变化。结果显示,单独SB431542处理组大鼠骨密度较对照组明显升高,氟联合SB431542组中骨密度比相同浓度单氟处理组轻微升高,提示SB431542很可能抑制骨转换过程提高了骨密度,这一变化趋势在成骨、破骨基因水平上得到印证。相比于单氟处理组,SB431542联合氟处理明显降低了Runx2和RANKL的表达。此外,血清中PINP和CTX的表达也受SB431542的影响而降低。检测TGF-β1相关因子的表达发现,ALK5的表达受SB431542的抑制降低,Smad3的表达明显也低于单氟组。与对照组相比,单独SB431542处理抑制了P38MAPK的表达。与高氟处理组相比,高氟联合SB431542使P38MAPK的表达轻微下降。通过体内实验结果表明TGF-β1很可能通过P38MAPK以及Smad3信号通路参与调节氟诱导的以骨吸收为主导的骨转换过程。体外实验我们选取破骨前体细胞RAW264.7为实验材料,经过染氟联合SB431542处理,进行MTT检测及骨吸收陷窝实验以观察细胞活性和分化。结果显示,与对照组相比,低氟刺激RAW264.7细胞活性。在低氟组(1mg F-/L和4mg F-/L)中骨陷窝面积增大,说明低氟对RAW264.7细胞诱导破骨方向分化具有促进作用。经过SB431542处理后,细胞增殖活性与单氟处理组相比明显下降。在SB431542联合低氟培养组中,骨陷窝面积较单氟处理组相比减小,表明SB431542处理抑制了破骨细胞分化能力。本次研究主要着重于TGF-β1在氟诱导的成骨细胞分化方面的影响,因此我们选取MC3T3-E1细胞和骨髓间充质干细胞(BMSCs)进行后续实验。成骨前体细胞MC3T3-E1进行染氟联合SB431542培养4天和7天后检测细胞增殖活性。结果显示低氟促进了MC3T3-E1细胞增殖,而高氟组(16mg F-/L)中细胞增殖明显受到抑制。经过SB431542处理后,细胞增殖活性比相同浓度单氟处理组下降。此外,利用Affymetrix mi RNA 4.0芯片及相关软件进行染氟组与对照组细胞mi RNA表达谱分析,结果表明一些已知与调控成骨密切相关的mi RNA在染氟MC3T3-E1细胞内表达显著增加。KEGG富集分析发现氟刺激成骨细胞TGF-β1及其下游Smad3和MAPK信号通路,同时也有Hedgehog、Notch和Wnt等调控成骨细胞分化的信号通路参与,说明氟通过激活多条成骨细胞分化信号网络来介导骨形成,验证了TGF-β1信号通路在氟骨症中的重要作用。体外培养BMSCs观察氟联合SB431542对成骨细胞早期分化的影响。取三周龄昆明小鼠,从股骨及胫骨中分离提取BMSCs,传至第三代得到稳定纯化的细胞。随后对细胞进行不同剂量染氟及联合SB431542处理,在实验中采用β-甘油磷酸钠、维生素C和地塞米松诱导其向成骨方向分化。培养一定天数后,MTT检测细胞增殖活性,并采用钙钴法和茜素红染色观察细胞成骨方向分化情况。同时应用免疫细胞化学染色,实时定量PCR和Western blot检测成骨以及TGF-β1相关因子的表达。结果显示,低剂量氟刺激细胞增殖活性,而高剂量氟则对其起到抑制作用。相比于对照组,低氟增强碱性磷酸酶活性,但高氟对碱性磷酸酶活性有抑制作用。在低氟组中,钙盐沉积明显,矿化结节面积较大,而在高氟组中,矿化结节与对照组相比减少。与对照组相比,低氟刺激了Runx2基因和蛋白的表达,但在高氟组中Runx2的表达降低。此外,TGF-β1相关因子的表达也受到氟的影响发生变化。1mg F-/L浓度氟对ALK5基因的表达具有促进作用,但16mg F-/L浓度氟对其具有抑制作用。氟对Smad3基因的表达具有抑制效果,这种抑制效果随着氟浓度的增加而增强。氟可以促进MAPK基因的表达,并且随着氟浓度的增大,MAPK的表达逐渐升高。经过SB431542处理后,细胞增殖活性比单氟组下降,碱性磷酸酶活性减弱。在染氟联合SB431542组中,虽然有钙盐沉积,但是矿化结节几乎不见。OCN和Runx2蛋白的表达也较单氟组相比降低。实时定量PCR结果显示,Runx2基因的表达与单氟组相比明显降低。检测TGF-β1相关因子的表达发现,在氟联合SB431542处理组中,ALK5的表达与相同浓度单氟处理组相比明显受到抑制。4mg F-/L以及16mg F-/L氟联合SB431542处理后,MAPK的表达低于相同浓度单氟处理组。此外,Smad3基因以及Smad2/3蛋白的表达在低氟联合SB431542组中相对下降,在高氟联合SB431542组中相对上升。P-Smad2/3蛋白在染氟联合SB431542处理组中较相同浓度单氟组明显降低。这些结果说明了TGF-β1在氟刺激成骨细胞活性和分化过程中有着重要作用,TGF-β1通过介导MAPK通路正向调节这种氟作用机制,Smad3信号途径很可能对成骨分化起到一定的负向调节。结论:体内实验表明过量氟积累能够造成以骨转换加速为特征的氟骨症。体外实验提示氟对破骨细胞和成骨细胞活性与分化具有双向作用,即低剂量的氟刺激两种细胞活性和分化,而高剂量氟抑制二者活性和分化。联合使用不同剂量氟和SB431542对大鼠和体外细胞进行处理,结果显示TGF-β1在氟诱导的骨转换以及刺激破骨细胞和成骨细胞活性及分化方面具有重要作用。体内、外实验表明SB431542显著影响了骨吸收过程以及破骨、成骨细胞分化能力,干扰了骨转换过程。此外,基因水平分析发现TGF-β1主要通过Smad3信号途径促进RANKL表达来介导骨吸收过程,同时通过Smad3途径负向调控Runx2表达对成骨过程和成骨细胞分化发挥作用。相应地,本实验还发现TGF-β1主要通过MAPK信号途径正向介导氟刺激骨形成以及诱导成骨细胞和分化。