对虾是我国重要的水产经济动物,但是病原微生物导致的疾病给对虾养殖业造成了巨大损失。因此,研究病原与对虾的互作机制以及对虾的抗病免疫机理对防御疾病以及促进对虾抗病育种工作具有重要的基础理论和应用意义。本研究以传染性肌肉坏死病毒(Infectious myonecrosis virus,IMNV)编码的多肽1以及凡纳滨对虾的半乳糖凝集素和Akirin为对象,分别研究了三者在病毒感染以及对虾抗菌免疫中的作用。传染性肌肉坏死病是由传染性肌肉坏死病毒引起的,主要感染对象是凡纳滨对虾。患病对虾出现肌肉坏死、白浊并且在对虾养成期会达到70%的累计死亡率。前期研究预测到IMNV基因组的开放阅读框1编码的多肽1(Peptide 1,P1)是一种双链RNA(ds RNA)结合蛋白(ds RNA binding domain,ds RBD),但是P1在IMNV感染对虾中的功能并不清楚。本研究通过P1及其突变体的原核表达、凝胶迁移阻滞试验、快速蛋白液相色谱、多角度光散射分析、RNA干扰报告试验、下拉试验等证明P1能通过结合ds RNA和小干扰RNA(small interfering RNA,si RNA)抑制宿主抗病毒的RNA干扰通路,很可能是IMNV破坏对虾抗病毒免疫RNA干扰的一种途径。半乳糖凝集素是一种重要的模式识别受体而Akirin是NF-κB通路下游的核转录辅助因子,因此本文还利用基因克隆、原核表达、RNA干扰、细菌的结合和吞噬试验等研究了凡纳滨对虾的半乳糖凝集素和Akirin在对虾抗细菌免疫中的功能。本文主要内容及结果如下:1.P1通过其C端“αβββα”型的ds RBD结合ds RNA由于起始密码子的不确定性,P1可能存在长短不同的两种蛋白,分别是LP1(Long P1,1-196 aa)和SP1(Short P1,56-196 aa)。本研究通过对LP1的保守结构域预测,发现其N端有一个蛋白结合域,C端有一个“αβββα”型ds RNA结合域。为了验证P1是否有结合ds RNA的活性,本研究首先利用原核表达的LP1和SP1蛋白与90 bp的ds RNA进行凝胶迁移阻滞试验,发现LP1和SP1均能结合ds RNA但是在胶孔处形成了大的复合体。考虑到P1的N端预测到一个蛋白结合域,LP1和SP1可能通过其N端的蛋白结合域形成了同源多聚体,当这一多聚体结合ds RNA后会形成更大的复合体。于是本研究仅利用不含蛋白结合域的P1的C端(SSP1,super short P1)进行凝胶迁移阻滞试验证明SSP1结合ds RNA后迁移良好,不再停滞在胶孔。SSP1突变体的凝胶迁移阻滞试验进一步证明了参与P1结合ds RNA的保守氨基酸(H128、K151、K154)。SSP1的梯度凝胶迁移阻滞试验发现,1分子SSP1能够结合8-9 bp的ds RNA,这符合经典的“αβββα”型ds RBD结合ds RNA的特征。2.LP1或SP1通过其N端的蛋白结合域形成了同源多聚体P1的凝胶迁移阻滞试验间接表明LP1或者SP1可能通过N端形成了同源多聚体。本研究进一步对LP1的N端序列分析,发现了两个可能的蛋白互作基序(64-ILKLL-68和79-ILHLL-83)。为了验证P1是否形成了自身多聚体以及预测的蛋白互作基序是否参与了多聚体的形成,本研究利用原核表达的LP1、SP1、SSP1及LP1在蛋白互作基序处的突变体进行的化学交联试验初步表明LP1及SP1通过N端的蛋白结合域形成了同源多聚体,并且其N端的蛋白基序64-ILKLL-68和79-ILHLL-83参与了多聚体的形成。P1及其突变体的快速蛋白液相色谱进一步证明了这一结果。SP1的多角度光散射分析证明其至少以自身二聚体的形式存在。3.P1通过结合ds RNA和si RNA抑制宿主抗病毒的RNA干扰免疫RNA干扰是真核生物抵抗病毒感染的一种重要的免疫途径,而某些病毒会编码蛋白抑制宿主的RNA干扰达到保护自身的目的。本研究利用以双荧光素酶为基础的RNA干扰(RNAi)报告试验证明P1的C端和N端能够独立地抑制ds RNA介导的RNAi。P1在ds RNA结合域的突变体的RNAi报告试验进一步表明P1的C端抑制RNAi是因为其能竞争性地结合ds RNA,从而阻止ds RNA被宿主的核糖核酸内切酶Dicer-2切割。除此之外,LP1和SSP1能够抑制si RNA介导的RNAi。凝胶迁移阻滞试验发现SSP1结合21nt si RNA,从而阻止si RNA装配到RNA诱导沉默复合体发挥作用。总之,P1能够在ds RNA和si RNA水平上抑制宿主的RNA干扰免疫。4.P1定位于果蝇S2细胞的细胞质和细胞核亚细胞定位试验发现LP1分布在果蝇S2细胞的细胞质和细胞核。病毒蛋白的类泛素化是其进入细胞核的一种途径。通过对LP1的序列进行类泛素化预测发现其含有可能的类泛素化基序,但是利用不含类泛素化基序的SSP1进行亚细胞定位发现SSP1同样可以进入细胞核。而且体外的下拉试验以及免疫共沉淀发现LP1并没有结合到参与类泛素化反应的凡纳滨对虾的UBC9蛋白和成熟体的类泛素分子。因此,P1的入核机制及是否被类泛素化还需要深入研究。5.凡纳滨对虾半乳糖凝集素基因的克隆及免疫功能研究本研究首次在凡纳滨对虾中克隆到了一种半乳糖凝集素(Litopenaeus vannamei galectin,Lv Gal)基因,预测其编码蛋白有338个氨基酸,预测发现其N端含有一个保守的糖类结合域。Lv Gal的序列分析发现其含有典型的糖结合的基序H-NPR与WG-ER的部分氨基酸。荧光实时定量PCR检测发现Lv Gal组成性表达在所检测各个组织中,在血细胞和鳃中的表达量较高。Lv Gal的m RNA在鳗弧菌刺激后的6和12小时表达上调,这预示着其可能参与对虾对细菌感染的免疫应答。本研究接着利用原核表达的Lv Gal进行体外的细菌结合试验发现Lv Gal能够结合鳗弧菌和溶壁微球菌。细菌凝集试验表明Lv Gal能够以金属离子非依赖性的方式凝集鳗弧菌,但是并没有发现Lv Gal对鳗弧菌和溶壁微球菌具有抑菌活性。最后的体内试验表明Lv Gal促进了对虾血细胞对鳗弧菌的吞噬。因此,Lv Gal很可能是通过结合、凝集细菌并促进血细胞对细菌的吞噬而发挥作用的。6.凡纳滨对虾Akirin基因的克隆及免疫功能的初步研究Akirin是一种高度保守的核蛋白,其在果蝇中的免疫功能被认为是促进NF-κB依赖的抗菌肽基因的转录。本研究在凡纳滨对虾中克隆到了Akirin(Lv Akirin)并对其免疫功能进行了初步研究。经过预测分析,Lv Akirin有212个氨基酸,并且有两处典型的核定位信号分别是N端的24–30:PHKRRC和78–81:KRRK。多序列比对和系统进化树表明Lv Akirin与日本对虾的Akirin亲缘关系较近。Lv Akirin组成性表达在所检测的组织中,在精巢中表达量最高,其次是血细胞,这预示着Lv Akirin可能会像其他动物的Akirin一样,在对虾发育和免疫应答中起作用。Lv Akirin的m RNA在副溶血弧菌刺激后的2,6和24小时被检测到表达上调。利用RNAi技术特异性沉默Lv Akirin后检测相关抗菌肽基因的表达,发现AA-K型抗脂多糖因子、P型甲壳素和对虾素3a的表达出现了不同程度的下调。这表明Lv Akirin可能影响了抗菌肽基因的转录。本研究揭示了传染性肌肉坏死病毒编码的多肽1抑制抗病毒免疫RNAi的原理及途径,发现了凡纳滨对虾半乳糖凝集素在血细胞对病原菌吞噬中的功能,最后探索了凡纳滨对虾Akirin在对虾抗菌肽基因转录中的可能作用。这为深入了解对虾的抗病免疫机理以及促进对虾抗病选育工作提供了理论依据。