RNA沉默是真核生物用以抵御病毒等外来核酸入侵的保守机制，能够触发病毒核酸的同源降解从而阻止其侵染。病毒在与寄主长期互作的过程中也进化出相应的反防御机制即编码RNA沉默抑制子与之对抗。不同RNA沉默抑制子往往作用于RNA沉默过程的不同阶段，因此，RNA沉默抑制子作用方式的研究可以深入揭示RNA沉默机制以及寄主与病毒的互作规律，为制定有效的抗病毒策略提供理论依据。本研究对AC4、AC2、MDV068等病毒编码蛋白的沉默抑制活性进行了鉴定分析；同时构建原核表达载体，诱导表达并纯化获得AC2、NS1及NS1突变体蛋白；利用纯化的AC2、NS1及NS1突变体蛋白进行了siRNA结合特性分析；对本实验室鉴定的RNA沉默抑制子HVT063进行了三维结构模拟及亚细胞定位分析。主要研究结果如下：　　 (1)RNA沉默抑制子的筛选鉴定。根据GenBank已提交的相关序列信息设计特异性引物，从番茄黄化曲叶病毒山东泰安分离物(Tomato yellow leaf curl virus from Taian，Shandong，TYLCV-SDTA)中克隆AC4和AC2蛋白基因，马立克氏病病毒(Mareks disease virus，MDV)中克隆MDV068蛋白基因，并将其分别构建到植物双元表达载体pBI121上，转化根癌农杆菌GV3101，利用农杆菌介导的瞬时表达系统对上述蛋白的沉默抑制功能进行鉴定。结果表明，AC2蛋白具有弱的沉默抑制功能，为RNA沉默抑制子，而AC4和MDV068蛋白均不能有效抑制RNA沉默。本研究鉴定的AC2蛋白与已鉴定为沉默抑制子的其它AC2蛋白在氨基酸序列上同源性普遍较低，与其中一种的同源率较高，达到95％。　　 (2)几种RNA沉默抑制蛋白及突变体蛋白的原核表达及纯化。分别构建RNA沉默抑制子AC2、p19(番茄丛矮病毒编码)、NS1(禽流感病毒编码)蛋白的pET30a(+)原核表达载体，已有的研究证明，NS1通过结合siRNA实现其沉默抑制功能，而碱性氨基酸有利于蛋白与RNA的结合，为了确定NS1沉默抑制功能的关键位点及功能域，设计了NS1的3个单氨基酸突变体R35A(精氨酸突变为丙氨酸)、K41A(赖氨酸突变为丙氨酸)、R46A(精氨酸突变为丙氨酸)和缺失突变体△71-230、△61-230,同样构建原核表达载体；对上述蛋白进行诱导表达和纯化，获得了AC2、NS1及5种NS1突变体的纯化蛋白；对增加蛋白稳定性和溶解度的诱导条件及蛋白纯化条件进行了优化；制备了p19蛋白的多克隆抗体，检测效价为1:10000。　　 (3)NS1及其各突变体蛋白沉默抑制能力和siRNA结合能力分析。利用农杆菌瞬时侵染体系检测了NS1及其各突变体蛋白沉默抑制能力，结果表明，NS1的35位和46位精氨酸突变为丙氨酸后丧失沉默抑制功能，是沉默抑制功能域的必需氨基酸；41位精氨酸突变成丙氨酸不影响抑制功能。△71-230突变体能抑制单链RNA引起的沉默，61-230位氨基酸的缺失会使NS1丧失沉默抑制活性，因此1-70位氨基酸序列是沉默抑制功能的必需功能域。为了弄清NS1的沉默抑制功能是否受siRNA结合能力影响，利用凝胶阻滞实验分析了NS1及其各突变体蛋白与21bpsiRNA的结合效率，结果证明，除△61-230突变体蛋白基本不结合siRNA外，NS1及其余各突变体蛋白与siRNA均有不同程度的结合，结合能力从强到弱依次为△71-230、NS1、R35A、K41A、R46A，各突变体抑制沉默的能力和siRNA结合能力不完全对应，NS1蛋白35位、41位、46位氨基酸突变均显著影响与siRNA的结合能力，但第41位精氨酸突变成丙氨酸却不影响其沉默抑制功能，这说明与siRNA的结合可能并不是NS1蛋白发挥沉默抑制功能的唯一方式；仅保留1-70位的缺失突变(△71-230)，siRNA结合能力反而增强，可能是大片段缺失改变了蛋白的空间折叠方式，使之更有利于与siRNA的结合。另外，研究表明AC2与siRNA有较弱结合。　　 (4)HVT063蛋白三维结构模拟及亚细胞定位。利用Ⅰ-TASSER蛋白质结构预测软件对本实验室鉴定的火鸡疱疹病毒编码的RNA沉默抑制子-HVT063蛋白的三维立体结构进行模拟分析，结果显示，HVT063蛋白主要由N端β片层区(8个β片层)和C端α螺旋区(9个α螺旋)组成，且两个区域都可能与RNA结合功能相关，初步预测HVT063蛋白像p19蛋白一样，通过两个分子间α螺旋和β折叠结合形成同源二聚体的方式与RNA结合。为了进一步了解HVT063的作用方式，构建了HVT063蛋白与GFP蛋白的融合表达载体，进行了洋葱和本生烟表皮细胞的亚细胞定位分析，结果发现，融合表达的HVT063蛋白在细胞核与细胞质中均有分布，这与NCBI数据库中提到的核质穿梭特性一致，也符合相关软件的预测结果。