单宁酶(Tannase)是一种特异性水解酶,它可以水解没食子酸单宁中的酯键和缩酚羧键,生成没食子酸和葡萄糖等其他化合物,也能水解茶饮料冷后产生的沉淀(“茶乳洛”)。单宁酶在食品、饲料、化妆品、医药和制革等方面都具有广阔的应用前景,已引起人们的广泛关注。目前,我国单宁酶的生产主要依靠曲霉发酵来进行,生产效率偏低,产品酶活多在200U/g左右,价格却高达200元/kg。因此,急需通过构建安全高效的工程菌来提高单宁酶的生产能力。本研究以实验室建立的具有自主产权的食品级黑曲霉表达系统为基础,利用PCR方法从黑曲霉基因组中扩增单宁酶基因tan的编码区,构建其黑曲霉表达载体pSZH-tan。通过农杆菌介导法将tan基因导入黑曲霉中,并将其整合到高表达的糖化酶基因位点,以实现tan基因在黑曲霉中的同源高效表达,为培育单宁酶工程菌奠定基础。主要研究结果如下：1.单宁酶基因黑曲霉转化子的获得以黑曲霉菌株CICC2462的基因组DNA为模板,利用PCR扩增单宁酶基因(tan),将其与黑曲霉表达载体pSZHG连接,构建了单宁酶基因黑曲霉表达载体pSZH-tan。采用冻融法将黑曲霉表达载体pSZH-tan转化入农杆菌AGL1中,并利用农杆菌介导法将tan基因导入黑曲霉。经PCR鉴定,tan基因转化的阳性率为50%。利用同源重组引物对4株阳性菌株做PCR鉴定,4株阳性转化子均可扩增出约1701bp的目的条带,均为同源重组转化子,同源重组率为100%。利用重组引物筛选和PCR鉴定,获得4株同源重组转化子。对转化子的表达产物进行SDS-PAGE分析和酶活检测。2.单宁酶基因在黑曲霉中的表达在摇瓶发酵条件下,重组菌株发酵液上清中单宁酶酶活最高为41.12U/mL,是出发菌株(2.98U/mL)的13.80倍。取发酵液上清进行SDS-PAGE,发现在约76KDa处有一条明显目的蛋白带。经ALPHAIMAGER SYSTEMS软件分析,重组菌株单宁酶的表达量为322μg/mL～581p.g/mL,说明单宁酶基因在黑曲霉中获得高效表达。