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口腔癌是威胁人类健康的主要肿瘤之一，已成为全球第九大好发性肿瘤，其中又以口腔鳞癌居多，具有生长快速、易侵袭和破坏邻近组织的特点，并且还可发生远处转移。虽然外科手术治疗的发展有了长足地进步，但是创伤大，易复发仍是尚未解决的难题，如何寻找到针对肿瘤的特异性的基因治疗已然成为如今的研究热点。通过前期研究发现LASP-1（LIM and SH3 protein1）蛋白主要位于肌动蛋白结合区域并参与细胞骨架的构成，在细胞趋化运动、迁移、黏附等过程中发挥重要作用。已有研究指出LASP-1在乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、成神经管细胞瘤以及肝细胞癌均呈高表达，且与患者临床病理特征相关。但LASP-1与口腔肿瘤疾病的认识还有待深入，其是否可作为肿瘤基因治疗的候选基因仍需探讨。 目的： 由于LASP-1在人口腔鳞癌中的表达及其对细胞增殖和迁移能力影响的研究少见报道。为此本研究采用RNA干扰技术抑制人口腔鳞癌SCC9细胞中LASP-1的表达，观察LASP-1对SCC9细胞增殖和迁移能力的影响。 方法: （1）细胞培养 人口腔鳞癌细胞株SCC9培养于DMEM/f12培养基，培养基中加入10％胎牛血清（澳洲），室温下37°C，5% CO2温箱培养。 （2）慢病毒包装和转导 将病毒包装辅助质粒（pMD2G and PsPAX2）和shRNA表达质粒共转染至人胚肾细胞293T中。48h后，12000g离心收集。将SCC9以3X104 cells/ml密度接种到6孔板上。以MOI=50的病毒滴度进行转染，三天后使用荧光显微镜（CKX41， Olympus）进行GFP表达观察。 （3）定量RT-PCR和Western blot测定LASP-1表达情况 qRT-PCR通过TAKARA公司 SYBR?Premix Ex TaqII（Tli RNaseh Plus)系统完成。操作按照试剂盒说明书进行；BCA Protein assay测定蛋白浓度，将每份裂解的产物上样、电泳、封闭后，分别用一抗、二抗进行孵育。运用ECL发光液+胶片进行显色，β-actin作为蛋白质内参。 （4）CCK-8法检测细胞增殖情况 应用CCK-8试剂盒检测细胞增殖水平。设置空白对照孔，全自动定量绘图酶标仪（Bio-Rad730）测量OD490m光吸收值，每组实验重复3次。 （5）FACS（流式细胞仪）检测分析细胞周期 经过胰蛋白酶消化后，4°C预冷的PBS洗涤细胞3次，离心弃上清，70%无水乙醇吹散细胞团块后4°C固定过夜，PI染料避光室温孵育半小时。流式细胞仪（FACS Aria TMⅢ）进行检测。 （6）Transwell实验检测细胞迁移能力 取对数生长期细胞，制备单细胞悬液，细胞加入transwell小室的上室中，而下室则加入10%胎牛血清的完全细胞培养基，培养24 h，加入4%多聚甲醛室温固定10 min，0.25%结晶紫染料染色15 min。 （7）SEM扫描电镜观察细胞微观形态学状态 根据实验分组，将细胞稀释至5x103/ml，接种1ml于细胞爬片，将爬片置于24孔板中，培养48h后，25%戊二醛固定30min，酒精（50%，75%，80%，90%，100%）梯度脱水，经零点干燥仪处理后，爬片表面进行喷砂导电，扫描电镜下观察细胞形态。 （8）统计分析 检测结果以（X±S）表示，检验水准为0.05。采用SPSS20.0统计软件对数据进行统计分析，采用one-way ANOVA进行分析，方差齐时使用LSD法对各组数据进行多重比较，若经Levene检验，数据不满足方差齐性，则采用Dunnett’s T3检验进行两两比较。 结果: （1）经嘌呤霉素筛选培养基培养7天后，检测发现阴性对照组和空白对照细胞组内LASP-1 mRNA和蛋白表达无明显差别。但实验组SCC9细胞的mRNA和蛋白表达水平明显下降。 （2）经过分析发现，阴性对照组和空白对照组无明显区别，shRNA-LASP-1-Lv实验组的相对增殖生长率在2-6天均出现明显抑制。 （3）LASP-1基因沉默可以阻滞细胞周期S期，SCC9阴性对照组21.68%±2.94%升高至实验组30.53%±2.85%（F=14.18，P＜0.05）；G2/M期从阴性对照组5.50%±0.71%下降到实验组3.50%±0.89%（F=5.29，P＜0.05）。而阴性对照组和空白细胞组G2/M和S没有显著差别。 （4）对细胞穿过聚碳酸酯膜进行计数发现，空白对照组和阴性对照组SCC9均有多数细胞穿过，两组间均无明显差异。而实验组有较少细胞到达下室，具有显著统计学差异。SEM电镜下观察细胞伪足，实验组细胞伪足相对减少。 结论: （1）慢病毒载体介导的shRNA-LASP-1-Lv可以显著下调人口腔鳞癌细胞SCC9中LASP-1的mRNA和蛋白表达。 （2）LASP-1基因沉默诱导导致SCC9细胞增殖水平降低，并且使细胞周期阻滞在S期，导致G2/M期降低。 （3）低表达LASP-1的SCC9细胞迁移能力下降，细胞跨膜运动能力减弱，SE M电镜下观察发现其细胞伪足相对减少。