论文部分内容阅读
罱茄(Solanum lycopersicum L.)适宜生长的日温为20-25℃,夜间为16-20℃。一般番茄品种,低于15℃时种子发芽、授粉受精及番茄转红受到影响;高于30℃时种子发芽率、发芽势、萌发指数均下降,高于34℃时生殖发育受到影响,高于40℃时植株发生生理紊乱而热死。高温对花粉发育的影响直接关系到授粉受精过程及最终的果实和种子质量与产量。本研究选用Micro-Tom番茄为研究对象,主要研究番茄花粉发育阶段遭遇7d的35℃/30℃的高温后,其小孢子和花药发育的细胞学变化;借助于番茄基因组芯片研究小孢子在四分体时期和双核时期的高温胁迫前后的表达谱差异,筛选在花粉中表达的热胁迫响应基因进行时空表达分析。对耐热番茄‘BL1175’和热敏感番茄‘LA2006’进行35/30℃的高温胁迫,研究目标基因在它们中的时空表达特性。本研究旨在阐明热胁迫对番茄小孢子发育的细胞学影响,揭示高温胁迫对番茄不同发育阶段小孢子的表达谱影响规律,筛选在花粉中表达的热胁迫响应基因并获悉其时空表达特性,探索番茄热胁迫响应和耐热的分子机制,为培育耐热番茄新品种提供理论依据。主要研究结果如下:1)以番茄品种’Micro-Tom’为材料,利用形态观察、DAPI染色、石蜡切片等方法,将正常情况下番茄小孢子发生过程划分为5个阶段。研究发现35℃/30℃高温胁迫处理不仅导致花粉畸形或败育、花粉数量减少、活力低萌发力差,而且还导致花药绒毡层、药隔组织、药室内壁、花药表皮、环状细胞簇等花药细胞结构的发育异常,并确定番茄花粉发育过程对高温最敏感的时期是四分体小孢子时期和双核花粉粒时期。2)通过利用基因芯片对生长于正常温度(25℃/20℃)与热胁迫温度(35℃/30℃)下的Micro-Tom番茄四分体时期和双核期花药转录组表达谱进行比较分析,从中获得了大量高温胁迫下番茄花药转录组信息和花粉发育相关基因。对差异基因的功能分类表明,高温胁迫对番茄花粉发育四分体时期和双核期的生物学过程影响主要集中在非生物胁迫响应、转录调控、细胞构建、信号转导、碳水化合物代谢、脂质代谢等类别。3)利用RT-PCR技术分析了SlMAPKs在小孢子发育四分体时期和双核时期热胁迫处理前后在花药中的表达特性。实验结果表明,高温下,SlMAPK1、SlMAPK3、SIMAPK7、SlMAPK12和SlMAPK16在番茄小孢子发育过程中均上调表达,但最高峰出现时材料所受高温处理时问的长短不同。4)从芯片中筛选出16个高温下与番茄小孢子发育相关的重要基因,qRT-PCR法进行时空表达分析显示,LeARG2、TFHS1和WRKY4在小孢子发育的四分体时期显著上调表达;HSP70、TAGL12、SlMAPK3、SlMAPK7、MAP3Ka在双核时期显著上调表达;GPAT、 TMP和Frk1在四分体时期显著下调表达;EXPA5在双核时期显著下调表达;Rnale在四分体时期显著上调表达,而在双核时期显著下调表达;Cel5在四分体时期显著下调表达,而在双核时期显著上调表达;LOC543824(alternative oxidase1a)在这两个时期均上调表达;MAPK12在四分体时期表达量略下降,而在双核时期表达量略上升,但都不显著。5)高温下,耐热番茄‘BL1175’比热敏感番茄‘LA2006’具有更强的细胞膜热稳定性、更高的SOD活性、花粉活力和萌发率。对处于开花期的耐热番茄‘BL1175’和热敏感番茄‘LA2006’进行35℃/30℃热处理,以小孢子发育的四分体时期花药为材料,对LeARG2,FRK1,MAPK3和MAPK7这4个基因进行了qRT-PCR分析,结果表明这4个热胁迫相关基因对番茄耐受高温具有重要意义。同时不同基因型番茄对高温胁迫的响应存在较大差异,热胁迫下热敏感番茄的多胺等抗高温物质水平较低、花粉萌发率较低等在此得到分子水平上的验证。