【目的】乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一。在一些发达国家，乳腺癌的发病率占女性恶性肿瘤的首位。近年来，我国乳腺癌的发病率呈明显上升趋势，严重威胁广大女性的身心健康。放射治疗是乳腺癌综合治疗的重要手段之一，可以提高乳腺癌患者的生存质量及远期生存率。但由于个体之间或肿瘤细胞本身存在放射敏感性差异，以及临床应用中多种因素都会影响放疗的效果，往往导致放疗效果不佳。因此，在放疗中，如何利用各种辅助手段降低肿瘤的辐射抗性，从而提高肿瘤的辐射敏感性成为重要的研究课题。虽然人们很早就开始进行该方面的研究，但迄今为止，一直未能找到一种较理想的低毒高效的辐射增敏剂应用于临床实践。近年来，随着microRNA（即miRNA）研究的不断深入，发现miRNA在肿瘤发生发展及治疗中都发挥了重要的作用。因此，从miRNA途径研究提高肿瘤细胞辐射敏感性便成了一种极有发展前景的新思路。MiRNA是一类新发现的长度约22nt、广泛存在于动植物中、对基因的调控起着重要作用的单链非编码小RNA。MiRNA主要通过与靶基因mRNA的3’端非编码区(3’-UTR)完全或不完全互补配对，导致靶mRNA降解或者抑制其翻译，负性调控靶基因的表达。在乳腺癌的发生发展转移等过程中，许多miRNA表达都发生了改变，主要有let-7家族，miR-34，miR-125a和125b，miR-200家族，miR-205，miR-10，miR-21，miR-17-92家族等。文献报道，电离辐射可以引起miRNA表达谱发生改变，外源性给予miRNA可以增加肿瘤细胞对辐射的敏感性，如miR145，miR-7和miR-34等，但是乳腺癌的辐射敏感性可能还有其它miRNA参与调节。本课题组前期研究发现miR-200c在辐射致癌组织中明显下调，增加其表达可以显著增加细胞的DNA损伤。MiR-200c在许多肿瘤中通常扮演着肿瘤抑制基因的角色，被认为是调节肿瘤EMT过程（epithelial-to-mesenchymal transition）及侵袭和转移的重要基因，其表达水平的改变与肿瘤的预后有关，特别是它还与肿瘤化疗药物耐受有关，但其在肿瘤细胞的辐射耐受性或辐射敏感性方面是否发挥了一定的作用还未见报道。因此，本课题的目的就是研究miR-200c对乳腺癌细胞的辐射敏感性方面的影响，并探讨其可能的分子机理，期望为提高乳腺癌的放射治疗效果提供新出路。【方法】本课题以两株miR-200c表达不同的乳腺癌细胞株为研究对象，分以下三个部分探讨miR-200c对乳腺癌细胞的辐射敏感性方面的影响及其机理。第一部分：miR-200c与乳腺癌细胞辐射敏感性的关系1、用细胞克隆形成法检测两株乳腺癌细胞的辐射敏感性。2、实时荧光定量PCR法检测两种乳腺癌细胞的miR-200c表达水平及辐射对miR-200c表达水平的影响。3、通过CCK8法和细胞克隆形成法检测miR-200c抑制剂对乳腺癌细胞辐射敏感性的影响。第二部分：miR-200c对乳腺癌细胞的辐射增敏作用1、采用CCK8法和细胞克隆形成法检测外源性增加miR-200c联合γ射线照射对乳腺癌细胞增殖作用的影响。2、利用流式细胞技术检测外源性增加miR-200c联合γ射线照射对乳腺癌细胞凋亡作用的影响。3、H2AX Foci免疫荧光法检测外源性增加miR-200c联合γ射线照射对乳腺癌细胞DNA双链断裂（DSB）的影响。第三部分：探讨miR-200c的辐射敏感性的分子机制1、用荧光定量PCR检测给予去甲基化后乳腺癌细胞的miR-200c的表达变化。2、生物信息学预测，TBK1可能是miR-200c的直接靶点；并用双荧光报告基因实验和western blot进行验证；3、采用CCK8法和细胞克隆形成法检测抑制TBK1表达后联合γ射线照射对乳腺癌细胞增殖作用的影响4、检测过表达TBK1是否可以逆转miR-200c介导的辐射敏感性。【结果】第一部分：miR-200c与乳腺癌细胞辐射敏感性的关系1、MCF-7细胞(SF2,0.5±0.03)的miR-200c表达水平显著高于MDA-MB-231细胞，而且辐射敏感性也高于MDA-MB-231细胞(SF2,0.8±0.53)。2、不同剂量γ射线照射后两株乳腺癌细胞的miR-200c表达显著上调，上调程度成剂量依赖性。3、瞬时转染miR-200c inhibitor48h后可以显著下调乳腺癌细胞的miR-200c表达水平。与单纯照射组相比，外源性抑制miR-200c可以部分逆转γ射线诱导的乳腺癌细胞增殖抑制（CCK8法：细胞存活率从单纯8Gy照射的75.5%提高到86.5%；细胞克隆形成法：细胞存活率从单独4Gy照射的7.9%提高到15.8%）第二部分：miR-200c对乳腺癌细胞的辐射增敏作用1、与单纯照射组相比，外源性增加miR-200c联合γ射线照射抑制两种乳腺癌细胞增殖，单独给予miR-200c也可以抑制增殖。2、与单纯照射组相比，外源性增加miR-200c联合γ射线照射诱导两种乳腺癌细胞的凋亡，单独给予miR-200c也可以诱导细胞凋亡。如MDA-MB-231细胞，单纯照射8Gy的凋亡率为11%，而照后过表达miR-200c组的凋亡率达30%以上。3、与单纯照射组相比，外源性增加miR-200c联合γ射线照射促进两种乳腺癌细胞的DSB的H2AX foci形成。如MCF-7细胞，对照组约有90%的细胞不含foci，而转过表达miR-200c组只有45%的细胞不含foci，33%的细胞含有成1-10个foci/cell。给予8Gy照射后，对照组有43%的细胞不含foci，而过表达miR-200c组只有17%细胞不含foci，高达37%的细胞含有＞10个foci/cell。MDA-MB-231细胞中也体现类似的结果。第三部分：探讨miR-200c的辐射敏感性的分子机制1、与空白组比较，给予甲基化抑制剂5-aza后可以上调MDA-MB-231细胞中miR-200c的表达。2、生物信息学预测显示，miR-200c的可能靶点有很多，其中包括我们感兴趣的蛋白TBK1。TBK13’UTR区存在与miR-200c的种子区互补的序列，提示，miR-200c可能靶向TBK1。双荧光报告基因结果显示，与阴性对照组相比，miR-200c可以显著抑制人TBK13’UTR野生型的报告基因活性，而不能抑制人TBK13’UTR突变型的报告基因活性。此外，Western blot结果显示，miR-200c可以调节乳腺癌细胞内TBK1蛋白的表达。3、沉默TBK1可以增加乳腺癌细胞的辐射敏感性。与单纯照射组相比，沉默TBK1表达后，联合γ射线照射可以抑制乳腺癌细胞增殖（CCK8法：存活率从单纯8Gy照射的88.1%降至66.8%；细胞克隆形成法：从单独4Gy照射26.7%降到19.2%）。4、通过过表达TBK1质粒上调TBK1蛋白水平，可以部分逆转miR-200c诱导的辐射增敏效果。过表达miR-200c的直接靶点ZEB1和ZEB2也能部分逆转其辐射增敏效果。【结论】1．首次提出miR-200c的低表达可能是导致肿瘤辐射耐受的原因之一。2．首次在实验中证明了miR-200c可以增加人类乳腺癌细胞的辐射敏感性。3．首次成功预测并证明了TBK1是miR-200c的直接靶点。推测miR-200c可能是通过抑制TBK1的表达，从而抑制Akt途径，增加乳腺癌细胞的辐射敏感性。