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杨树是我国发展人工林的主要栽培树种之一,是重要的工业原料,黑杨是其中较大的一组,经济价值和遗传价值极高,而三倍体黑杨相对于二倍体黑杨具有生长速度快,植株更为高大粗壮等生长优势。由于林木遗传背景复杂,因此相关的基础研究滞后,杨树基因组测序的完成,给杨树的研究带来了前所未有的契机。microRNA(miRNA)是一类主要在转录后水平上调节基因表达的非编码小分子RNA,长度多数为19~25 nt。研究表明miRNA在植物的生长发育、对环境条件的胁迫应答及其它生理生化反应中均起着重要的调控作用。
本研究以二倍体及三倍体黑杨的幼嫩的叶片和老叶片为材料,利用高通量测序技术、颈环引物反转录法,实时定量PCR技术、转基因技术及生物信息学方法,对一些与生长发育相关的miRNA的表达和功能进行初步研究,试图从miRNA的角度对黑杨多倍体优势形成的机理进行分析。主要结果如下:
(1)利用新一代测序技术,对黑杨二倍体和三倍体进行小RNA测序,一共获得来自110个家族的773个miRNA,其中三倍体黑杨特有的miRNA为284个,二倍体黑杨特有的125个,在二倍体、三倍体共有的364个miRNA中,黑杨三倍体中表达量大于二倍体(2x vs.3x<1)的共有132个,占到总数的36%,小于二倍体(2x vs.3x>1)的有184个,比例为51%,表达量相同的为48个,比例为13%。二倍体和三倍体中新预测的miRNA10个;
(2)利用RT-qPCR检测了miR159、miR164、miR167、miR171、miR319在黑杨二倍体和三倍体中的表达情况。所有的检测对象在不同部位都有表达,表达模式均与测序结果一致,其中miR159、miR167、miR171、miR319在三倍体幼叶中高表达。miR164的在老叶中高表达。暗示这些miRNA与三倍体速生性状形成相关。
(3)成功构建了miR164两个前体及一条在二倍体与三倍体中共有的新miRNA前体过表达载体,通过农杆菌介导法成功转入拟南芥中,得到转基因植株;为下一步进行功能分析打下了基础。
(4)对新预测的未知的miRNA的靶基因进行了预测,通过生物信息学分析推测该未知miRNA参与了植物生长过程中的多个代谢途径。