棉花组蛋白乙酰基转移酶GENERAL CONTROL NON-REPRESSIBLE 5调控纤维发育的初步研究

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组蛋白乙酰化修饰是由组蛋白乙酰基转移酶(HAT,Histone acetyltransferase)和组蛋白去乙酰化酶(HDAC,Histone deacetylases)相互作用,动态调控细胞核内组蛋白的乙酰化程度,从而调控基因表达的一个过程,它在表观遗传过程中发挥着十分重要的作用。GCN5(GENERAL CONTROL NON-REPRESSIBLE 5)是组蛋白乙酰基转移酶家族中十分重要的成员之一,已经被证实在植物的生长发育过程中发挥着重要的作用。植物中GCN5的突变导致多样性的生长缺陷,包括分生组织功能异常、丧失顶端优势、矮化、花瓣变短、雄花变短等。GCN5还参与调节各种生物过程,如细胞分化、幼体到成体的转变、脂肪酸的生物合成、角质蜡质层的积累、新生芽再生、雌蕊发育等。同时,GCN5基因在植物抵御非生物胁迫方面也发挥着重要的作用,比如,参与热应激反应,调节植物体内铁的稳态,以及抵御光,冷,磷酸盐缺失等非生物胁迫的过程等。但它在棉花发育中的作用还不清楚。因此,本研究利用陆地棉基因组数据进行鉴定,筛选以及分析了组蛋白乙酰基转移酶(HAT)基因家族的成员,探究了其蛋白的特性并初步研究了GhGCN5_A11在棉纤维发育中的作用。具体结果如下:1.我们对陆地棉、亚洲棉、海岛棉、水稻以及可可基因数据库中的HAT家族的成员进行了全基因组鉴定,分别鉴定出了7个水稻基因,12个可可基因,11个亚洲棉基因,25个陆地棉基因和25个海岛棉基因。将其与拟南芥HAT家族的成员(12个基因)共同构建了系统进化树,系统发育分析结果表明:它们进化保守,在不同的物种中均形成4个亚族。对陆地棉中的25个HAT家族基因进行基因结构与蛋白域的分析表明,陆地棉中不同亚族的HAT成员的基因结构和蛋白功能域都十分保守。对它们在棉花中各个组织的表达模式进行分析发现,GhGCN5_A11在棉花纤维发育起始阶段高量表达。2.在烟草中瞬时表达GhGCN5_A11与绿色荧光蛋白(GFP)的融合表达载体,结果显示GhGCN5_A11定位在细胞核上。通过原核表达系统,诱导表达和纯化了GST-GhGCN5_A11融合蛋白,并进行蛋白免疫印迹杂交(western blot)和酶活体外检测验证了其组蛋白乙酰基转移酶活性。通过蛋白互作预测和查阅文献我们发现,组蛋白H3.3(Gh HH3-22,Gh05G2150)与其表达模式相近,为可能的乙酰化靶点,于是进行了酵母双杂以及双分子荧光互补(Bimolecular Fluorescent Complimentary,Bi FC)实验进行验证,结果表明二者在体内外均可以互作,GhGCN5_A11可以通过作用于组蛋白Gh HH3-22进行乙酰化修饰。3.对gcn5-5突变体以及GhGCN5_A11超表达拟南芥的表皮毛进行观察发现,与野生型对照相比,突变体叶片表皮毛数量减少,超表达拟南芥的叶片表皮毛数量增多。在陆地棉中,通过VIGS技术将GhGCN5_A11基因沉默后发现,沉默株系的棉纤维长度变短,纤维起始发育变缓。证明GhGCN5_A11可以促进拟南芥表皮毛的发育,并在棉花胚珠纤维起始发育以及棉纤维的伸长过程发挥作用。4.运用实时荧光定量法(q RT-PCR)对GhGCN5_A11影响表皮毛发育的可能的下游基因进行了筛选与检测,发现GhGCN5_A11可能通过调控GL1、GL2、GL3和GA途径的一些基因的转录表达,从而调控棉花纤维的发育。
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