圆红冬孢酵母(Rhodotorula toruloides)可在胞内积累油脂、类胡萝卜素等,具有巨大的工业应用潜力。目前已经获得了R.toruloides的多组学信息,建立了基于农杆菌介导转化(Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation,ATMT)和电击转化(Electroporation transformation)的R.toruloides遗传操作方法。这为改善R.toruloides的生产性状,优化其代谢通路,建立有效的遗传操作系统提供依据。R.toruloides可以利用自身DNA断裂修复机制来进行基因编辑,然而R.toruloides的非同源末端连接(Non-homologous end joining,NHEJ)机制占主导地位,同源性重组修复(Homologous recombination,HR)机制效率极低,难以通过同源重组的方式进行靶基因的定点敲除。针对以上问题,本论文尝试通过对R.toruloides中非同源末端连接机制关键基因KU70进行基因敲降或敲除,并过表达同源重组机制关键蛋白Rad52,从而弱化R.toruloides的非同源末端连接机制,提高同源重组效率,达到调控DNA断裂修复机制的目的。主要研究内容及成果如下:本论文利用RNA干扰(RNAi)方法对R.toruloides单倍体菌株NP11的非同源末端连接机制关键基因KU70进行敲降,获得了9株ku70-RNAi工程菌株。经RT-PCR分析发现,8株ku70-RNAi工程菌株中KU70基因在转录水平显著降低。以ku70-RNAi为出发菌株,利用电击转化方法分别导入CRT和MET15基因敲除盒,得到了CRT基因敲除工程菌株;其中,CRT基因敲除白色菌株,表达CRT基因可回补颜色表型。说明ku70-RNAi菌株的同源重组效率提高。同时,构建了不同靶位点的KU70敲除载体,利用CRISPR-cas9系统,对NP11的KU70基因进行敲除,获得了1株KU70碱基缺失35 bp的工程菌株(?KU70(1005 bp–1039 bp),ku70~-)。以ku70~-为出发菌株,通过电击转化分别导入URA5和MET15基因敲除盒,得到表型正确的工程菌株。以上工作和课题组建立起的CRISPR-Cas9编辑技术配合使用,将对圆红冬孢酵母代谢通路调控和合成生物学研究具有重要意义。