目的:核仁磷酸蛋白(nucleophosmin,NPM1)基因突变是急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)中最常见的分子遗传学异常。因其独特的临床特征和基因表达谱,NPM1突变AML作为单独的一类疾病亚型被纳入2016年WHO白血病分型指南中,而NPM1突变蛋白异常易位至胞质是该亚型白血病最显著的病理学特征。本课题组前期研究发现,NPM1突变蛋白能够增强白血病细胞的自噬活性,进而促进细胞的体外增殖。然而,胞质NPM1突变蛋白参与调控自噬激活的分子机制尚未完全阐明。方法:首先利用TCGA和GEO数据库分析NPM1突变AML患者细胞中自噬相关基因的差异表达,采用western blot和qRT-PCR检测ULK1、ATG3、ATG7在人髓系白血病细胞系及白血病原始细胞中的表达。结合免疫共沉淀(Co-IP)和免疫荧光(IF)技术观察白血病细胞中NPM1突变蛋白与ULK1蛋白的相互作用。观察干扰或者过表达NPM1-mA(NPM1 type A mutation)后白血病细胞中ULK1蛋白和mRNA水平的变化。采用Cycloheximide处理结合western blot观察NPM1-mA对ULK1蛋白稳定性的调控作用。同时,观察干扰或过表达NPM1-mA后ULK1磷酸化底物ATG13磷酸化水平的改变。接下来,通过镍(His-tag)亲和纯化技术检测NPM1-mA表达对ULK1泛素化水平的影响。此外,在白血病细胞中过表达或者干扰ULK1后,采用western blot检测自噬标志物LC3 II和p62的表达水平,并通过克隆形成和CCK-8实验观察细胞体外增殖能力。最后,通过rescue实验观察敲低或过表达NPM1-mA后回复ULK1或者ULK1抑制剂SBI-0206965处理对白血病细胞自噬活性和体外增殖的影响。结果:NPM1突变的AML细胞高表达自噬核心蛋白ULK1,且NPM1-mA与ULK1蛋白存在相互作用。此外,NPM1-mA能够上调ULK1的蛋白表达水平,而对其mRNA水平无显著影响。从机制上来看,过表达NPM1-mA能够正向调控ULK1蛋白的稳定性和激酶活性。值得注意的是,外源性表达NPM1-mA可以增强TRAF6对ULK1的泛素化修饰。ULK1能够增强白血病细胞中自噬标志物LC3 II表达、减弱p62表达以及促进白血病细胞的体外增殖。最后,在rescue实验中回复ULK1水平或使用ULK1抑制剂SBI-0206965处理能部分逆转敲低或者过表达NPM1-mA对自噬活性和细胞增殖的影响。结论:白血病细胞NPM1-mA可与ULK1蛋白相互作用,正向调控ULK1蛋白水平。机制上,NPM1-mA通过TRAF6调控ULK1的泛素化,从而维持ULK1的蛋白稳定性和激酶活性,最终促进NPM1突变白血病细胞的自噬性细胞存活。本研究为探讨胞质NPM1突变蛋白参与调控自噬激活的分子机制提供了新的理论依据。