肝素(Heparin, Hep)是由不同硫酸化程度的葡萄糖胺和葡萄糖醛酸／艾杜糖醛酸二糖单位所组成的粘多糖,是目前临床上最重要的抗凝血和抗血栓药物。然而,凝血因子FXa和FIIa一直存在于血液中,而Hep则仅由肥大细胞合成、贮存和释放,只有在受到刺激时才释放出来。血液持续在血管中流动而不发生血栓的原因在于与血液直接接触的血管内皮细胞表面表达有与Hep类似的抗凝物质——硫酸乙酰肝素(Heparan Sulfate, HS)。故Hep在肥大细胞内的天然活性并不是抗凝。已有证据表明,Hep的强电负性使其与肥大细胞颗粒中多种物质的贮存及活性的发挥密切相关,但这些研究大多是在细胞外、分子水平上进行的。Hep作为肥大细胞颗粒中的重要组成成分,在研究其天然活性时,必需要以肥大细胞为对象来进行。Hep生物合成是在以N-乙酰葡糖胺和D-普通糖醛酸为双糖单位聚合的未硫酸化的多糖链上逐步完成的,共包括五步反应,第一步是GlcNAc的N-脱乙酰、N-硫酸化。该步反应是Hep生物合成中至关重要的一步反应。N-脱乙酰-N-磺基转移酶(N-deacetylase/N-sulfotransferase, NDST)-2即为催化该步反应的酶类。理论上来讲,抑制该步反应必然会导致Hep生物合成的阻断,从而使肥大细胞颗粒内出现Hep缺失。慢病毒载体是一类重组逆转录病毒载体,其优点有感染效率高,可有效感染原代细胞和非分裂期细胞,能够实现携带基因片段的稳定表达等。本课题即采用慢病毒载体特异性抑制大鼠腹腔肥大细胞(Rat peritoneal mast cells, RPMC)内的NDST-2,制造Hep合成受阻的肥大细胞,考察此时RPMC形态变化、颗粒内介质含量及脱颗粒过程,进而探讨Hep在肥大细胞内的天然活性。本课题的研究内容及成果主要包括四个文面：1RPMC的分离及鉴定提取大鼠腹腔悬液并采用梯度密度离心法分离纯化RPMC,经阿利新蓝-蕃红染色法、硫酸小檗碱染色法鉴别确定所提细胞主要为RPMC,经流式细胞术检测细胞表面IgE抗体鉴定其纯度达88.3%。确立了RPMC的分离方法。2RPMC的体外长期培养系统采用不同浓度的干细胞生长因子(Stem cell factor, SCF)、白介素3(Interleukin-3, IL-3)和白介素4(Interleukin-4, IL-4)单独或联合应用体外培养RPMC,分别于第7、14、21天进行阿利新蓝-蕃红染色法观察其对RPMC存活及Hep表达情况的影响,选择RPMC长期存活且Hep表达情况最佳的培养条件为模型条件以进行后期实验。结果显示SCF是维持RPMC存活的必要条件,目.单独使用SCF对RPMC中Hep表达最有利。IL-3的使用则会促进RPMC分化,由合成Hep转为合成硫酸软骨素(Chondroitin sulfate, CS)。IL-4也有一定促分化作用,但不如IL-3强。3慢病毒介导抑制RPMC中NDST-2的表达以阴性对照慢病毒分别在有无聚凝胺的条件下以1、10、50、100感染复数(Multiplicity of Infection, MOI)感染RPMC,荧光显微镜观察及流式细胞术检测荧光细胞比例来确定最佳感染条件。以最佳感染条件分别将4种NDST-2慢病毒感染RPMC, western-blot检测其NDST-2表达情况以筛选最佳干扰序列。结果显示在5μg/mL polybrene, MOI为100时为最佳感染条件,感染效率可达90%。NDST-24号慢病毒干扰效果最佳,抑制率可达90%以上4NDST-2抑制后RPMC生物学活性的变化NDST-24号慢病毒感染RPMC,在第6、12、18天进行阿利新蓝-蕃红染色,观察NDST-2抑制后Hep表达情况,选择最佳检测时间。进行NDST-2抑制后RPMC颗粒内介质含量的检测及脱颗粒介质释放率的检测,FM4-64膜荧光染料染色观察脱颗粒时细胞变化。结果显示感染第12天为最佳检测时间,胞内Hep表达大幅下降。组胺、类胰蛋白酶含量均有不同程度的下降,β-氨基已糖苷酶含量则无明显变化。NDST-2干扰组脱颗粒程度较阴性对照组要低。以上结果表明,Hep在肥大细胞的作用为辅助肥大细胞颗粒贮存组胺、类胰蛋白酶等生物活性物质,且可对肥大细胞脱颗粒程度产生影响。