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酶联免疫吸附分析(ELISA)是目前各种传染病临床检测的常规方法。辣根过氧化物酶(HRP)催化过氧化氢(H2O2)氧化邻苯二胺(OPD)反应体系被广泛用于ELISA，但通常被视为单底物反应处理，有关HRP催化双底物反应的研究很少见到报道，而且OPD具有潜在的致癌作用。因此，本文利用分光光度法对HRP催化H2O2氧化OPD反应机制进行了理论分析和实验论证；探索了HRP催化H2O2氧化还原性罗丹明B(R.Rh.B)新反应体系，大大减少了OPD的用量，有望取代HRP催化H2O2氧化OPD反应体系，应用于酶联免疫吸附分析；将HRP催化双底物反应动力学方程与朗伯.比耳定律相结合，给出了HRP催化动力学光度法的理论依据；确定了HRP催化双底物反应机制，测定了HRP催化动力学参数，为固定化酶催化动力学的研究奠定了基础。
生物酶的应用对绿色化学具有重大意义，但生物酶是一种十分昂贵的试剂，固定化酶可以大大降低生产成本。酶的固定化是利用一些化学方法将酶固定在载体上，使酶既能保持原有的活性，而又能不妨碍被分析物的自由扩散。固定化酶具有热稳性高、可重复使用、不需要在反应后进行催化物质与反应物分离等优点，在工农业生产、临床治疗以及基础理论研究应用前景广阔。本文初步研究了利用自组装技术固定HRP的新方法。
本论文主要在以下三个方面得到了较为满意的结果。
1.HRP催化H2O2氧化OPD体系的动力学研究
利用分光光度法对HRP催化H2O2氧化OPD生成2,3-二氨基酚嗪(DAP)反应进行了动力学研究，在pH4.75，温度为22℃时，确定了该反应体系H2O2的最佳浓度范围为1.4×10-3～4.2×10-3mol/L，OPD的最佳浓度范围为4.0×10-3～1.1×10-2mol/L。然后固定H2O2(或OPD)的浓度，连续改变OPD(或H2O2)的浓度，测定反应初速率。用Line weaver-Burk双倒数作图法以1/V对1/[H2O2](或1/[OPD])作图，得到一组相互平行的直线，证明此反应为乒乓机制。通过二次作图，求得最大反应速率V=2.58×10-5mol/L·min，HRP催化OPD的米氏常数KOPDm=7.30×10～mol/L，HRP催化H2O2的米氏常数KH2O2=2.89×10-3mol/L。实验所获得的Line weaver-Burk双倒数图具有良好的线性关系，实验结果准确可靠。并对该反应体系中两种底物对酶的抑制作用进行了较为系统的研究，确定了两种底物对酶的抑制浓度。
2.HRP催化H2O2氧化R.Rh.B体系的动力学研究
为了探索一种污染程度小的HRP催化反应体系，利用分光光度法对HRP催化H2O2氧化R.Rh.B生成罗丹明B(Rh.B)反应体系进行了动力学研究，在最佳pH7.5，最佳温度为22℃时，确定H2O2的最佳浓度范围为7.1×10-6～2.1×10-5mol/L，R.Rh.B的最佳浓度范围为3.2×10-7～4.0×10-6mol/L。然后固定H2O2(或R.Rh.B)的浓度，连续改变R.Rh.B(或H2O2)的浓度，测定反应初速率，绘制Line weaver-Burk双倒数图。结果表明此反应符合乒乓机制，最大反应速率Vm=2.78×10-7mol/L·min，HRP催化H2O2的米氏常数KH2o2m=3.38×10-5mol/L，HRP催化R.Rh.B的米氏常数KR.Rh.Bm=7.53×10-6mol/L。研究发现该反应体系的两种底物对酶都具有抑制作用，并确定了两种底物对酶的抑制浓度。
3.自组装技术固定HRP的新方法
研究了HRP在4-MBA自组装单分子膜上的固定化，确定了固定HRP的最佳条件为0.04 mol/LpH7.4的磷酸盐缓冲溶液(PBS)；固定化HRP催化反应的最佳反应底液为pH4.5的柠檬酸.磷酸氢二钠缓冲溶液(CBS)；同时研究了HRP在4-MBA和对羟基苯硫酚(4-HTP)混合硫醇自组装单分子膜(SAMs)上的固定化效果。实验结果较为满意，为固定化酶的进一步研究奠定了基础。