异戊二烯作为一种重要的平台化合物,在橡胶以及精细化工行业有广泛的应用。目前,异戊二烯生产方法主要有C5馏分分离法,化学合成法及脱氢法。但这些化学合成工艺对石油资源依赖性强,并且容易产生环境污染,因此需要研究可替代的以可再生生物质为原料的生物异戊二烯生产工艺与方法。本课题进行了两种异戊二烯生物合成工艺的改进性研究:一是对现有的工程大肠杆菌进行代谢工程改造和发酵工艺优化提高发酵效率,二是建立并优化异戊二烯的体外酶法合成工艺。本研究首先通过基因工程方法对实验室已有的生物异戊二烯工程菌进行了代谢工程改造,构建了一株改造后的工程大肠杆菌E.coli BL21（DE3）::Trclow△adhE△ackA。主要改造策略是敲除了竞争性的旁路代谢途径基因乙醇脱氢酶基因（adhE）与乙酸激酶基因（ackA）,以减少发酵副产物乙酸和乙醇的生成;同时在工程菌的基因组内导入异戊二烯下游代谢途的酶基因,以提高菌株的发酵稳定性,改造后的菌株以甲羟戊酸为底物的异戊二烯发酵稳定性好,副产物乙酸乙醇的含量低,并可实现异戊二烯与乳酸的共发酵（二者在此研究中无代谢竞争）。而后本研究对与该菌株配套的发酵工艺进行了优化。优化试验结果表明该菌株的最佳培养基是高密度发酵培养基（20 g/L葡萄糖,0.24 g/L MgSO₄,5 g/L牛肉浸粉,2.5g/L KH₂PO₄,1 g/L甜菜碱,3 g/L（NH₄）₂SO₄,1 g/L一水合柠檬酸,1 g/L柠檬酸三钠,1.86 g/L KCl,80 mg/L FeSO₄·7H2O）,诱导剂的最适终浓度是0.5 mmol/L,pH最佳调节方式是氨水调节。利用该菌株在摇瓶水平采用优化后的工艺发酵培养36小时后,异戊二烯的产量为85.8 mg/L,乳酸的产量达到16.9 g/L,副产物乙醇的产量减少约50%,乙酸产量减少约47%。另外本研究还对异戊二烯的体外酶法合成工艺进行了研究。研究策略是应用合成生物学原理,在细胞外构建由多种酶及其辅助因子共同参与的催化体系。本研究体外酶法所使用的酶是异戊二烯下游途径的五个酶（可催化甲羟戊酸至异戊二烯的合成）。实验首先经过菌株培养,诱导表达,超声破碎,镍柱纯化,超滤等步骤得到这几个纯化的酶,而后通过初步建立的多酶体外催化体系对甲羟戊酸底物浓度,ATP浓度以及五个酶的最佳配比等方面做了优化。实验结果显示以甲羟戊酸为底物生产异戊二烯最佳的体外酶反应体系为:磷酸钾缓冲液50 mmol/L,KCl 30 mmol/L,MgCl₂ 10 mmol/L,β-巯基乙醇4 mmol/L,ATP 10 mmol/L,甲羟戊酸2.5mmol/L,最佳酶浓度配比MVK:PMK:MVD:IDI:ISPS=1:1:1:2:16。另外,我们通过对照试验将体外与体内的异戊二烯合成方法进行了对比,对照试验结果显示,体外酶法生产异戊二烯的方法比全细胞生产方法具有更高的生产率,并且持续的有效生产时间更长。利用体外酶法工艺持续反应40小时,异戊二烯产量可达到302mg/L。