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2020年突如其来的新型冠状病毒肺炎疫情肆虐全球。经过科研人员对病人体内分离出的病毒样本测序,该致病因子被鉴定为严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）。SARS-CoV-2与严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-Co V）基因组序列有80%的相似性。病毒主要通过与宿主的血管紧张素酶2（ACE2）相结合后侵入细胞引发感染。截至2021年3月1日,SARS-CoV-2的迅速传播已经造成全球上亿人感染,两百余万人死亡,给各国人民的生命健康带来严重威胁。当前,因缺乏对病毒感染过程详细分子机制的研究,仍无生产出特效药物治疗新型冠状病毒肺炎。因此,理解病毒生命周期中病毒的复制与组装等重要分子事件和潜在机制,对遏制SARS-CoV-2的全球蔓延具有重要意义。SARS-CoV-2是一种单链正股RNA病毒,基因组约长30 kb,具有5’帽子和3’多聚A尾结构,共编码29个蛋白质,包括刺突（S）、膜（M）、囊膜（E）、核衣壳（N）四种结构蛋白质。我们的研究主要发现了RNA能够诱发N蛋白质发生相分离（liquid-liquid phase separation,LLPS）。本研究中我们使用生物信息学工具IUPred2和ANCHOR2对SARS-CoV-2基因组编码的29个蛋白质进行分析,发现N蛋白质存在多个固有无序序列（Intrinsically Disordered Region,IDR）,具有相分离的潜力。N蛋白质约为46 k Da,主要有两种功能:包裹病毒基因组RNA（genomic RNA,g RNA）,防止被模式识别受体（PRR）所识别;调节病毒g RNA的转录与复制。为了研究N蛋白质的相分离过程,我们首先利用蛋白质原核表达纯化系统获得了高纯度的N蛋白质,通过凝胶迁移实验（Electrophoretic Mobility Shift Assay,EMSA）发现N蛋白质具有与RNA结合的能力。在体外相分离实验中通过Time-lapse和荧光漂白恢复（Fluorescence Recovery After Photobleaching,FRAP）等实验,我们发现SARS-CoV-2 RNA（v RNA）可以诱导N蛋白质发生液滴样聚集,并且液滴的荧光可以在漂白后数秒内恢复。同时,在N蛋白质诱导表达的H1299细胞中,v RNA能够诱发N蛋白质产生点状聚集（foci）。以上结果证明了v RNA能够诱发N蛋白质的相分离。进一步实验发现,除v RNA外,多种RNA模拟物也可以诱发N蛋白质的相分离。蛋白质的相分离是一个环境依赖的过程,我们发现N蛋白质的相分离会受到RNA浓度、蛋白质浓度、p H、盐离子浓度和RNA长度等因素的调控。N蛋白质是所有冠状病毒共有的结构蛋白质。序列分析发现,SARS-CoV-2的N蛋白质与SARS-Co V的N蛋白质的氨基酸序列相似性高达90%。SARS-CoV-2的N蛋白质具有N端和C端两个球形结构域（NTD和CTD）,分别负责RNA的结合和N蛋白质的二聚化。为了进一步探索N蛋白质中调控相分离过程的关键区域,我们通过构建N蛋白质不同结构域的截短体,发现全长（Full Length,FL）的N蛋白质与RNA的结合能力最强。通过体外相分离实验发现,N蛋白质缺乏NTD、CTD结构域或IDR均无法发生相分离。自COVID-19疫情发生后,众多科学家陆续提交SARS-CoV-2的基因组序列至GIASID数据库。我们从数据库中获得了100849种SARS-CoV-2的基因组序列,分析发现,尽管在N蛋白质的编码序列中有众多的突变,但约有37%的N蛋白质的编码序列存在一处集中的突变,该突变发生在第608、609、610位的三个碱基,由GGG突变为AAC,最终导致蛋白质序列第203位由精氨酸（R）变为赖氨酸（K）,第204位由甘氨酸（G）转变为精氨酸（R）,突变的蛋白质被命名为NR203K/G204R。为了进一步评价N蛋白质突变后相分离的能力,我们纯化了NR203K/G204R蛋白质,并与RNA共孵育后发现,NR203K/G204R蛋白质较NR203/G204蛋白质具有更强的相分离能力。同时我们设想新冠病人的死亡率是否与NR203K/G204R蛋白质的多态性相关联,我们通过分析发现,N蛋白质的此种多态性与已报道的病人死亡率没有明显关系。综上所述,本研究发现了RNA能够诱发SARS-CoV-2 N蛋白质的相分离,此过程受到多种因素的调控。NTD、CTD结构域或IDR是N蛋白质正常相分离的必需结构,进一步发现突变体NR203K/G204R具有更强的相分离能力。上述发现有助于更好地理解N蛋白质的生物学功能,提示病毒感染细胞后N蛋白质可能与病毒RNA形成液滴样结构,保护病毒g RNA的稳定。我们的工作不但揭示了RNA-蛋白质相分离调控新冠病毒组装的新机制,还提示通过破坏SARS-CoV-2感染时RNA与N蛋白质的相分离过程,有望为开发选择性阻断药物和防治新型冠状病毒感染提供全新的科学依据。