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法国农业科学院Frey等采用基因工程方法,将?-Km间座子插入到青枯病原菌的hrp基因簇中构建获得了无致病力Hrp-突变体(简称Hrp-菌株)。该菌株对该野生致病菌引起的茄科青枯病的防效普遍达75%以上,且持效期长、稳定性好、安全无药害。此外,由于Hrp-菌株可正常侵染植物并在植物体内繁殖,受土壤环境和其它土壤微生物的影响较小,克服了生物防治中常出现的田间防治效果不稳定的缺陷。因此Hrp-菌株的确是一个颇具潜力的生防菌株,具有较好的商业化前景,对其进行发酵条件优化和剂型研究具有非常重要的意义。在摇瓶发酵条件下,采用全因子试验设计法、正交试验设计法和单因素设计法对工程菌Hrp-菌株的培养基配方进行优化,最终确定出该菌的最适发酵培养基配方为(g/L):葡萄糖8g、细玉米面5g、细豆饼粉35g、硫酸铵2g、酵母浸膏3g和酸水解酪蛋白1g。优化后的培养基配方使摇瓶发酵液菌量从初始发酵培养基的1.34×1010cfu/ml提高至3.45×1010cfu/ml,增幅为257.5%。采用Plackett-Burman设计法和响应面分析法对Hrp-菌株的发酵条件进行优化,获得的最佳发酵条件为:初始pH值8.75、装液量100ml/500ml、接种量6.25%、接种龄10h、温度20℃、摇瓶转速205r/min;在此条件下,Hrp-菌株的发酵液菌量由最初发酵条件下的1.34×1010cfu/ml提高到4.42×1010cfu/ml,增幅为329.9%。以摇瓶发酵试验为基础,进行了Hrp-菌株发酵由摇瓶到30L发酵罐的放大试验,考察了Hrp-菌株的发酵参数,包括发酵过程中的pH值、还原糖、氨基氮、溶解氧和活菌量参数的变化情况,确定了发酵周期为54h。连续上了三批发酵罐,结果表明,在30L发酵罐里Hrp-菌株的发酵液菌量可达1.28×1011cfu/ml,与摇瓶发酵相比菌量增幅为289.6%。对Hrp-菌株的固体剂型进行了初步的研究。经载体、保护剂和抑菌剂的筛选,最终得出固体菌剂的制作方法为:将发酵培养后的菌液置于离心管中,以5000r/min离心10min后弃上清,用无菌水洗两遍,离心收集菌泥。将菌泥加至石蜡油中,震荡15-20min使菌泥在石蜡油中充分分散。再将此菌液按1:1比例与灭菌后的草炭混合均匀,制成固体菌剂。最后再向这种固体菌剂中加入杂菌抑制剂乳酸链球菌素(0.075g/kg)和纳他霉素(0.3 g/kg),并混合均匀。此固体菌剂在pH值为5.3左右、含水量35%、不抽真空及温度25℃的条件下保存,6个月后,存活率维持在44.4%,有效活菌量为1.12×1010cfu/g。对Hrp-固体菌剂的田间防治效果进行研究。确定了移栽浸根处理法为最佳施用方法,并用此法进行田间防治效果试验,结果表明,经Hrp-固体菌剂稀释液(浓度5.0×108 cfu/ml)浸根处理番茄,移栽后30d的发病率为40.6 %,防效为58.6%。