论文部分内容阅读
1928年,自从青霉素被意外发现以来,在临床上广泛用于抵抗细菌性感染,它的成功带动了一个又一个抗生素的诞生。抗生素在细菌感染治疗中占据重要的位置,挽救了无数生命,时至今日抗生素的发现和发展仍然是现代医学最重要的进步之一。临床使用的β-内酰胺类抗生素主要分为四类:青霉素类、头孢菌素类、碳青霉烯类和单环β-内酰胺类,这些化合物都通过高活性的β-内酰胺环来发挥杀菌作用。β-内酰胺类抗生素的杀菌机制主要是破坏细菌细胞壁的合成,细菌细胞壁是由肽聚糖交织而成的“网状”结构。青霉素结合蛋白(PBPs)是细菌胞浆膜上的一类特殊膜蛋白,主要分布于G~+菌和G~-菌的细胞表面,它参与促进细胞壁中前后两个肽聚糖的聚合和交联。β-内酰胺类抗生素能竞争性地与细菌PBPs活性位点处的丝氨酸羟基共价结合形成丝氨酸脂,使PBPs失活,不能发挥其促进聚合的作用,前后两个肽聚糖单体间聚合受到阻断,影响肽桥的形成,细胞壁合成从而受阻,由于缺乏完整细胞壁的保护,细菌在恶劣环境下膨胀破裂最终死亡。自从青霉素等抗生素在临床上运用以来,迫于生存压力细菌不断进化,逐渐对各种抗生素产生了耐药性。细菌的耐药机制主要有4种:第一种是产生能够水解抗生素的β-内酰胺酶,使进入胞内的抗生素水解失活,第二种是改变抗生素结合位点PBPs的结构,使抗生素难以发挥作用,第三种是通过改变细菌外膜的通透性,使抗生素难以进入到胞内第四种是利用外排泵,将进入胞内的抗生素排出。其中,产生能够水解β-内酰胺类抗生素的β-内酰胺酶是最主要也是最具威胁性的耐药机制,是本课题的研究方向。β-内酰胺酶(Beta-lactamases,BLA)是耐药菌产生的能够水解β-内酰胺类抗生素的一种酶类,β-内酰胺酶利用其活性中心的水分子将其与抗生素的酰化复合物水解,得到失活的抗生素和保留活性的β-内酰胺酶。根据Ambler的分子结构分类法,β-内酰胺酶可分为A、B、C、D四大类,其中A、C、D类酶的活性位点上均含有Ser残基,而B类酶的活性位点上含有一个或几个金属锌离子,又称为金属β-内酰胺酶(MBLs)。为了应对由β-内酰胺酶引起的细菌耐药性问题,科学家们将β-内酰胺酶抑制剂与抗生素作为复方制剂联用,原理是:β-内酰胺酶抑制剂能够竞争性地结合β-内酰胺酶,占据其活性位点,使得β-内酰胺酶不能再去水解β-内酰胺类抗生素,从而增强β-内酰胺类抗生素的抑菌活性。目前,市场上的β-内酰胺酶抑制剂主要有经典的克拉维酸、舒巴坦、他唑巴坦以及新上市的阿维巴坦。克拉维酸、舒巴坦和他唑巴坦的结构类似性导致它们对β-内酰胺酶的作用机制的相似性,以克拉维酸为例:首先抑制剂与β-内酰胺酶发生非共价结合形成Michaelis复合体,然后70位丝氨酸的羟基进攻抑制剂内酰胺环上的羰基,导致内酰胺环开环形成酰化产物,接着恶唑环开环生成酮衍生物,最后在130位Ser的作用下,经过多步重排反应,生成了不可被水解的酶和β-内酰胺类抗生素的多种酰化产物,最终使酶失去活性,而抑制剂本身也被分解。所以三者都属于不可逆性抑制剂,也称为“自杀性抑制剂”。克拉维酸、舒巴坦和他唑巴坦只对大部分A类酶具有抑制作用,而不能抑制B、C、D类酶。由于细菌不断产生对抑制剂的耐药性,临床上迫切需要研发新型的广谱或针对性较强的β-内酰胺酶抑制剂来应对不断增多的MDR。阿维巴坦(Avibactam)属于二氮杂二环辛烷类化合物,化学结构式为(1R,2S,5R)-7-oxo-6-(sulfoxy)-1,6-diazabicyclo[3.2.1]octan-2-carboxam-ide。阿维巴坦是一种新型的β-内酰胺酶抑制剂,与经典β-内酰胺酶抑制剂的作用机制完全不同:β-内酰胺酶活性丝氨酸上的羟基亲核进攻阿维巴坦的酰胺键,使阿维巴坦开环,二者形成共价结合物——酶-抑制剂复合体,使酶处于抑制状态,再经环合阿维巴坦内酰胺环得到恢复。亲核进攻形成复合物的速率远远大于内酰胺环闭环的速率,导致β-内酰胺酶长时间处于稳定的抑制状态,在这个过程中,阿维巴坦可以恢复自身结构,所以它属于可逆性抑制剂。阿维巴坦对A类和C类β-内酰胺酶具有较强的抑制作用,对部分D类酶也有一定的抑制作用,比经典的β-内酰胺酶抑制剂更广谱、更强效,而且不会诱导β-内酰胺酶产生。阿维巴坦与头孢他啶等抗生素药物联用时,抗生素的抗菌活性得到大大增强,药代动力学性质良好,临床使用时没有严重不良事件报道。本文以阿维巴坦为先导化合物,基于本课题之前对阿维巴坦的结构改造结果分析,设计、合成了两类四元内酰胺环化合物,并对阳性化合物和目标化合物进行了初步的生物活性评价。分别测定了23个化合物对Class A类TEM-1、Class C类AmpC和Class D类OXA-23酶的抑制作用大小,以目标化合物对酶的百分抑制率来表示抑酶活性的大小。活性评价结果显示:在0.50nM下,有8个化合物对D类酶(OXA-23)的百分抑制率远远高于阳性化合物。由于目前临床上使用的β-内酰胺酶抑制剂都对D类酶几乎没有抑制作用,所以我们筛选出的8个化合物对于寻找D类β-内酰胺酶抑制剂具有重要的意义。