刚地弓形虫是一种专性寄生于的有核细胞内的寄生原虫,属于顶复门球虫纲,一旦感染会引起人兽共患弓形虫病。弓形虫以生活史复杂,感染宿主广泛闻名于世,几乎所有温血动物包括人类在内均可作为其中间宿主,被誉为最成功的寄生原虫。本研究构建两种弓形虫突变株,分别为从虫体的转化和入侵两方面研究提供一定帮助。(1)弓形虫速殖子缓殖子双荧光突变株的构建每当弓形虫速殖子首次入侵宿主时,通常导致急性感染,若处理不当产生严重并发症甚至死亡。而通常在免疫系统以及药物作用下,速殖子会逐渐转化为缓殖子,缓殖子聚集形成包囊,进而转变为慢性感染。慢性感染一般不呈现任何临床症状。而一旦宿主免疫系统减弱或抑制时,例如艾滋病和器官移植造成的免疫抑制时,缓殖子会重新转化为速殖子,重新引发急性感染症状。这种速殖子和缓殖子之间的相互转化导致了弓形虫病最大特点:机会致病性。但是对其转化的分子机制目前还不清楚。速殖子和缓殖子虽然是虫体的两种阶段,但在形态学上区别并不明显,肉眼不易区分。虽然缓殖子形成的包囊观察起来非常明显,但无法明确观察到速殖子与缓殖子间转化的过程,因此迫切需要一种较方便观察速殖子缓殖子间体外转化的平台。随着当前弓形虫转基因技术和弓形虫荧光蛋白技术应用及发展,用不同荧光蛋白标记速殖子与缓殖子,使我们能更好的观察速殖子缓殖子在体外的转化(张彦雷等2011)。本研究选取速殖子期和缓殖子期特异的两个基因SAG1和BAG1,以及两个时期共有基因GRA2。通过在NCBI和弓形虫基因数据库上检索分析,确定了SAG1和BAG1的启动子序列,以及GRA2的终止子序列,设计引物通过PCR从弓形虫基因组中获得这3段序列。然后通过overlap PCR,酶切等方法,使SAG1p后面连上绿荧光蛋白基因GFP和GRA2t;BAG1p后面连上红荧光蛋白RFP和GRA2t,并将连入同一个真核转染质粒pcDNA3.1(+),并添加一个药物筛选标记DHFR。之后通过电转化将该质粒导入弓形虫RH株,在通过体外药物培养获得了速殖子期发绿光的弓形虫。随后多次进行碱性诱导处理,尝试观察红荧光未果。本实验成功获得重组质粒,为后续构建双荧光虫体积累经验,且该荧光虫体能在体外培养中较容易的观察弓形虫速殖子与缓殖子的转化,能为研究速殖子和缓殖子相互转化的过程提供较便利的平台,也能为抗弓形虫新药的研究提供较方便的工具。(2)弓形虫微线体蛋白3敲除株的构建弓形虫之所以能感染如此众多的宿主,成功的入侵机制是关键所在。而在入侵宿主细胞的过程中顶端黏附是必不可少的阶段,在此阶段中,虫体分泌微线体蛋白(MIC)与宿主细胞表面蛋白或糖类进行相互作用,介导虫体的顶端和宿主细胞进行定向的黏附。可见微线体蛋白(MIC)对虫体致病性有着重要影响。本研究选择敲除MIC家族中的MIC3基因,该基因编码的分泌蛋白形成二聚体,介导虫体与宿主细胞的结合。利用CRISPR/Cas9基因敲除技术构建了两个质粒:MIC3敲除质粒和DHFR同源整合质粒,然后在根据基因组中MIC3序列上游、中间、下游序列设计了3个PCR反应来检测敲除的正确性。通过药物筛选传代培养,成功得到了MIC3基因缺失弓形虫株。然后利用该虫株进行了生长实验,噬斑实验和毒力实验等,对当MIC3基因缺失虫体在生长,形态,毒力等各种方面的变化进行了研究,发现当MIC基因3敲除后,虫体活力不但没有减弱相反促进其在细胞内生长产,并且对小鼠的毒力增强。这些变化为进一步揭示MIC3基因的机理提供实验依据,为后续研究MIC3基因对弓形虫生理意义提供一定的理论依据。同时证明了CRISPR/Cas9系统在弓形虫的基因敲除技术中也日臻成熟,为今后对弓形虫其它基因敲除修饰提供了帮助。